蛇床子素/壳聚糖衍生物胶束对去卵巢骨质疏松大鼠骨微结构和骨吸收的影响

郭杨 王礼宁 马勇* 郑苏阳 潘娅岚 孙杰 司誉豪 涂鹏程 徐桂华

1.南京中医药大学骨伤修复与重建新技术实验室，江苏 南京 210023 2.南京中医药大学附属医院骨伤科，江苏 南京 210029 3.南京中医药大学慢性病中医护理干预实验室，江苏 南京 210029

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMOP)就是由于骨形成和骨吸收失衡所造成的一种以骨密度降低、骨脆性增加为特征的全身性骨骼疾病[1]。其导致的脆性骨折等并发症将严重影响中老年人的生活质量，已成为全球性的健康问题。目前，市面上常见的抗骨质疏松药物如双膦酸类、雌激素受体类药均有吸收性差、不良反应较多的缺陷。因此，往往无法取得令人满意的疗效。

中医药已被证明具有抗骨质疏松潜能的天然产物备受人们的关注。蛇床子素(Osthole，OST)，作为中药蛇床子中一种主要的活性成分。现代药理学研究已发现其具有抗炎、护肝、抗肿瘤、延缓老年痴呆等药理作用[2-4]。本课题组前期体外研究发现：一方面，OST可以通过激活Wnt/β-Catenin信号通路和内质网应激从而刺激成骨细胞的增殖、分化，并最终促进新骨形成[5]；另一方面，OST也可以通过抑制NF-κB信号通路的表达而引起NFATc1等相关转录因子的下调来抑制破骨细胞的分化成熟[6]。然而，由于OST难溶于水且吸收性差，常造成药物生物利用度下降，为克服这些问题，课题组借助中医学“相须”理论和“药食同源”理念，合成了未见文献报道的新型蛇床子素/壳聚糖衍生物胶束(Osthole-loaded N-octyl-O-sulfonyl chitosan micelles, NSC-OST)，并初步在体外观察了其药效[7-8]，但其在体内药理作用的发挥尚需要进一步研究。因此，本文计划通过建立去卵巢骨质疏松大鼠模型，初步观察其对大鼠骨微结构与骨吸收现象的影响。

1 材料和方法

1.1 动物

SPF级未经产的3月龄雌性SD大鼠共40只，体重为(200±15)g，由南京市江宁区青龙山实验动物养殖场提供，实验动物合格证书：SCXK(苏)2012-0008。本研究项目的所有开展过程已得到南京中医药大学实验动物伦理委员会的批准(项目编号：ACU170804)。

1.2 试剂与仪器

试剂：蛇床子素标准品(中国食品药品检定研究院，HPLC>99.8%)；蛇床子素/壳聚糖衍生物胶束(NSC-OST)由中国药科大学合成并提供；尼尔雌醇(中国食品药品检定研究院)；抗酒石酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒(美国 SIGMA公司)；鼠抗大鼠NFATc1单克隆抗体(货号：sc-7294)、鼠抗大鼠CTSK单克隆抗体(货号：sc-48353)、鼠抗大鼠c-Fos单克隆抗体(货号：sc-166940)，购自美国SANTA CRUZ公司；二甲苯、HE染液、切片石蜡、脱钙液、多聚甲醛(南昌雨露病理生化试剂公司)；注射用青霉素钠(四川制药有限公司)、羧甲基纤维素钠(国药)。

仪器：倒置相差显微镜CKX31型(日本 Olympus光学仪器株式会社)；小动物Micro CT测试仪1176型(比利时 Skyscan公司)；全自动硬组织切片机RM2265型(德国 徕卡公司)；生物组织冷冻台YD-6 L型、生物组织包埋机YD-6 L型、生物组织烤片机YD-B型、组织染色机YD-700型，购自中国金华益迪公司。

1.3 动物造模与分组给药

造模方法：术前10 h禁食，手术当天用2.5%的戊巴比妥钠按照30 mg/kg的剂量进行腹腔麻醉，于肋下2 cm进行常规消毒，于脊柱两侧旁开约1.5 ～2 cm处行2 cm左右的切口，逐层剥离，找到桑葚样的卵巢后进行结扎并切除，术后3 d肌注青霉素预防伤口感染。

分组方法：分组及各组给药剂量具体如下：①假手术组给予等体积生理盐水(0.5%羧甲基纤维素钠)；②模型组给予等体积生理盐水(0.5%羧甲基纤维素钠)；③尼尔雌醇组按照1 mg/(kg.week)给药一次，每次给药3 mL，其余时间给予上述同体积溶剂灌胃；④蛇床子素组按照10 mg/(kg.d)给药，每天给药3 mL；⑤蛇床子素/壳聚糖衍生物胶束组按照100 mg/(kg.d)(OST的载药量为10%，OST实际含量保持一致)，每天给药3 mL；上述组别均连续灌胃12周后，麻醉后双侧胫骨和股骨-80 ℃保存备用。

1.4 Micro-CT

根据之前文献报道的协议[9]，设定CT扫描参数为分辨率9 μm、电压65 kV、电流384 mA和1 mm滤镜。扫描结束后，使用系统内置的软件Nrecon 1.6和CTAn 1.14对每一个标本选取统一的感兴趣区域(regions of interest, ROI)：距髁间窝生长板0.5 mm，长3 mm的一段松质骨进行重构，使用建模软件CTan分析构建二维与三维图像，采用上述软件进一步分析骨松质形态计量学参数，包括骨体积分数(BV/TV)、三维骨密度(3D BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)。

1.5 HE染色

将左侧股骨置于4%多聚甲醛中固定24 h后，用10% EDTA溶液脱钙4～6周，脱钙完成以针刺无阻力感为标准；截取1.5 cm左右股骨远端部分，并进行乙醇梯度脱水；二甲苯溶液透明；常规石蜡包埋；切取石蜡切片厚度为5 μm，常规行HE染色，中性树脂封片，倒置显微镜下观察骨组织的微形态结构。

1.6 TRAP染色

按照试剂盒说明配置新鲜的TRAP染液，将空白的石蜡切片放入预热37 ℃的染液中避光浸染1 h，然后用苏木精染液复染细胞核，蒸馏水漂洗、中性树脂封片后，显微镜下观察并采集图像后用图像分析软件Image Pro Plus 6.0分析单位骨小梁面积破骨细胞数(number of osteoclasts per bone surface, N. Oc/BS)和单位骨小梁破骨细胞面积比(osteoclast surface per bone surface, Oc. S/BS)。

1.7 免疫组化

将石蜡切片置于二甲苯溶液中脱蜡10 min，乙醇梯度(高至低：100%、95%、80%、70%)各2 min水化，先后用蒸馏水、PBS溶液漂洗3 min；室温下用预热的封闭通透液避光浸润切片30 min，PBS溶液漂洗两次，3 min/次；柠檬酸钠溶液抗原修复，微波炉里高火4 min至沸腾，然后自然冷却至室温，PBS溶液洗3次，3 min/次；血清封闭37 ℃温箱中30 min；一抗孵育4 ℃过夜，PBS漂洗3次，3 min/次；二抗孵育37 ℃ 1～2 h，PBS洗3次，3 min/次；DAB显色，显色后终止反应，苏木精复染30 s，水漂洗 15 min，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片；置于显微镜下观察。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 NSC-OST对股骨三维形态计量学参数的影响

Micro-CT扫描和三维重建是用来评估大鼠模型中的骨微观结构变化的有效手段。其中模型组对比假手术组表现出明显的骨小梁流失。然而，对比模型组，口服NSC-OST可明显提高大鼠的BMD和BV/TV(P<0.05)，并明显改善Tb.N、Tb.Sp、Tb.Th三项指标(P<0.05)(图1-A、1-B)，总体效果要优于OST组，但略逊于Nil组。表1。

2.2 NSC-OST对股骨组织病理学形态的影响

根据图2结果显示，Sham组大鼠骨小梁结构均匀分布，排列整齐并互相连接呈网状，形态较为完整；Ovx组骨小梁结构明显变细，骨皮质变薄，形态结构性差，有扭曲和断裂的现象，骨质疏松样改变典型。Nil、 OST组和NSC-OST组经过治疗后，骨组织形态结构改善明显，其中Nil组骨微结构的改善效果最明显，NSC-OST组次之，最后是OST组。具体表现为骨小梁稍细，排列尚整齐，排列部分呈网状，间隙略大，形态结构基本完整。

2.3 NSC-OST对股骨组织中破骨细胞数量的影响

染色结果显示，OVX组的破骨细胞较假手术组明显增多，OST和NSC-OST能明显抑制破骨细胞的生成，NSC-OST的抑制效果更明显(图3)。采用Image-J进行图像分析显示，模型组N. Oc/BS和Oc. S/BS较假手术组受到明显抑制(P<0.05)，药物组均能一定程度的改善这两项参数(P<0.05)，其中Nil组改善效果最明显，NSC-OST组次之，然后则是OST组(表2)。以上结果提示NSC-OST能在体内外均显著的抑制破骨细胞的生成和活性。

图1 NSC-OST对大鼠三维股骨微结构的影响注：A 股骨矢状面骨结构的二维扫描图； B 股骨骨微结构的三维建模图。Fig.1 Effect of NSC-OST on 3D femoral microstructure in rats

表1 NSC-OST对股骨三维形态计量学参数的影响Table 1 Effect of NSC-OST on 3D bone morphometrics

图2 各组股骨组织的HE染色结果(100×)Fig.2 HE staining results of femoral tissues in each group(100×)

2.4 NSC-OST对股骨组织中破骨细胞特异性分子的影响

股骨远端的免疫组化结果显示，OVX组中的NFATc1、c-fos、CTSK的表达较假手术组均显著增强，但Nil、OST、NSC-OST组干预后均能发挥不同程度地抑制作用。其中，Nil组和NSC-OST组在抑制NFATc1、c-fos方面效果较好，二者作用相当；Nil组抑制CTSK的作用最强，而OST组和NSC-OST组在该指标上作用相似，见图4。

图3 各组股骨组织的TRAP染色结果(200×)Fig.3 TRAP staining results of femoral tissues in each group(200×)

表2 NSC-OST对股骨破骨细胞数量参数的影响

图4 NSC-OST对破骨特异性标志分子NFATc1、c-Fos、CTSK的作用(n=3，200×)Fig.4 Effects of NSC-OST on osteoclast-specific molecules NFATc1, c-Fos, and CTSK in rat femurs (n=3, 200×)

3 讨论

配伍是中药处方的灵魂，而“相须”配伍作为复方中最常见的一种配伍方式，指的是性能功效相类似的两种药物配伍使用后可以增强某种或几种组成的治疗效应，本文中NSC-OST的合成制备思路正是来源于中医“相须”配伍的理论。另外，骨质疏松症的中医药防治讲究“药食同源”，常以动物的壳或骨用作药膳食材，而壳聚糖则正是来源于鱼虾蟹壳的主要成分——甲壳素，其来源广泛，并可通过结构修饰形成两亲性聚合物胶束，产生一定的亲骨性，再通过物理包埋药物，增溶难溶性药物，提高生物利用度[10]。同时，壳聚糖也具有促进骨形成效应的生物学作用，且已在骨组织工程中得到了一定范围的应用[11]。因此，基于OST在抗骨质疏松上表现出的良好前景，课题组前期成功制备了具有良好亲水性的NSC-OST，并在本文中进一步观察其对去卵巢骨质疏松大鼠模型的药理学效应。

Micro-CT扫描可以得到松质骨和皮质骨的骨三维图像，具有相当高的分辨率，通过软件分析可以较精确地测得骨量及相关骨微结构参数，是目前检测骨质疏松严重程度的最佳技术手段之一。造模后3D BMD、BV/TV的降低表示了骨量的下降，OST可以一定程度提高模型组的3D BMD、BV/TV值，而NSC-OST则强化了这一作用。Micro-CT还可直接分析获取骨小梁的参数，包括：Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp等，这些数据均提示了卵巢切除术可导致骨小梁数量减少，骨质进一步流失。而OST可一定程度上拮抗失去卵巢所引起的骨质疏松，但效果仍不如Nil。NSC-OST则进一步强化了OST的效果，可更有效地逆转骨小梁的减少，减缓骨质疏松的疾病进程。

而HE染色也验证了以上实验结果，提示NSC-OST可以显著改善大鼠股骨的骨微结构；同时综合大鼠股骨的TRAP染色结果发现：NSC-OST可以明显抑制N. Oc/BS和Oc. S/BS，抑制破骨细胞的生成，提示NSC-OST的抗骨质疏松效应可能和抑制破骨细胞分化的能力有关。

NFATc1是破骨细胞形成和分化过程中不可或缺的转录因子之一[12-14]。此外，NFATc1在破骨细胞的骨吸收功能的激活中也发挥了重要的作用[15]。NFATc1敲除的胚胎干细胞将无法成功分化为破骨细胞，然而破骨前体中NFATc1的异位表达又能使其在RANKL缺失的条件下成功分化，靶向破坏小鼠造血细胞中的NFATc1能使破骨细胞数量明显减少，骨量显著增加[16]。c-Fos作为NFATc1上游的重要调控分子，同时也是一种必不可少的RANK/RANKL通路下游转录因子[17]，c-Fos纯合子小鼠可表现为由于破骨细胞缺失而引起一系列骨硬化等功能障碍[18]。CTSK作为破骨细胞分泌的一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，骨骼中的胶原蛋白等其他基质可在骨吸收的过程中被其溶解。相关基因测序发现，CTSK突变的情况存在于常染色体隐形骨坏死患者(骨硬化症)，这一现象也符合高密度情况下的分子诊断结果[19]。本研究结果表明：造模后的大鼠股骨骨中破骨特异蛋白NFATc1、c-Fos和CTSK表达量明显上调，而NSC-OST可抑制上述蛋白的表达上调，NFATc1、c-Fos蛋白表达的抑制作用NSC-OST组与Nil组相当，而NSC-OST抑制CTSK与的作用则不如Nil组，与OST组相似。

综上，NSC-OST在体内良好药效的发挥，也进一步揭示了其作为一种安全有效的抗骨质疏松药物的潜能。本研究证明了在中医经典理论指导下合成的NSC-OST，其显著的抗骨质疏松的效应发挥与其对破骨细胞及其骨吸收的抑制作用有关，但其具体分子机制仍待进一步探究。