锌对断奶仔猪肠道屏障功能的影响

■刁 慧 张锦秀 晏家友 黄崇波 魏小兰 周梦佳 张 杰 舒妍婕

（1.四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室，四川成都610066；2. 四川省畜科饲料有限公司，四川成都610066）

仔猪在断奶阶段大脑皮层发育不健全，代谢机能旺盛，受到的营养、环境及心理等应激大，会导致肠道消化吸收、机体免疫和行为发生变化，表现为腹泻、生长发育迟缓、甚至死亡[1]。近年来，研究发现仔猪断奶应激会损伤肠道黏膜屏障功能和对病原菌先天免疫应答[2-3]。为了减少断奶给仔猪造成的负面影响，通常在营养、饲养管理、环境等方面进行改进[1]。锌是动物机体必需的微量元素，是机体多种酶的重要组成成分或激活因子，参与细胞内信号传导和细胞增殖，对生长发育、上皮完整性、抗氧化、免疫和繁殖等具有重要的生理和营养意义[4-5]。锌是继铜之后发现的在断奶仔猪上使用的又一高效微量元素促生长添加剂，能调节肠道菌群和减少组胺释放，有效缓解仔猪断奶应激造成的腹泻[6-7]。然而，研究发现，锌离子浓度过高会产生极大的细胞毒性[8]。因此，本文就锌的转运、吸收和生物学功能进行了比较全面的综述，重点论述了锌在断奶仔猪肠道屏障功能中的作用及高剂量锌对猪机体健康造成的危害。

1 锌的吸收转运

锌的吸收是一个跨细胞的过程。由于锌离子是亲水性带电离子，自身较难通过含阴离子的细胞膜，在机体内不能以简单的被动扩散方式进行跨膜转运，必须与配体结合从而完成肠细胞对锌的摄取。Evans等（1975）[9]研究发现，锌吸收模式分为三步：①吸收：胰腺可向肠腔中分泌一种锌结合体，肠腔中的锌与之结合后穿过肠黏膜细胞顶膜进入细胞；②细胞内转运：锌从肠黏膜细胞顶膜到基底膜；③进入血液：锌穿过小肠黏膜细胞基底膜，释放锌离子进入门脉循环。饲粮中大部分未被吸收的锌经粪便排出体外。两大锌转运蛋白在机体锌离子的吸收和转运过程发挥重要作用，这两大家族分别：负责降低细胞质中锌离子的ZNT家族和负责增加细胞质中锌离子的ZIP家族[10-11]。此外，金属硫蛋白和金属反应原件结合转录因子-1也参与到机体锌稳态的调控[12]。迄今为止，除了金属硫蛋白之外还没有发现其他的蛋白具有临时存储细胞中的锌的功能[13]。

作为一种微量营养素，锌在动物小肠被吸收入血进而转移到各个组织器官中。Methfessel 等（1973）[14]以Zn65作为标记，同时结合肠段结扎手段来研究大鼠对锌的吸收，结果表明锌吸收的最大部位为十二指肠，其次为空肠和回肠。Hampton 等（1976）[15]以Zn65作为标记，同时结合小肠注射手段来研究大鼠对锌的吸收，结果同样发现在饲喂不同浓度锌（锌缺乏、适宜锌、高锌）的情况下，最大吸收部位均为十二指肠。Hill 等（2014）[16]在仔猪上的研究发现，饲喂不同浓度锌（25～100 mg/kg），仔猪十二指肠金属硫蛋白的含量高于其他肠段，表明仔猪对锌的可利用性增加，间接说明十二指肠是锌的主要吸收场所。综上所述锌在动物体内的吸收发生在整个肠段，包括十二指肠、空肠和回肠，其中十二指肠是主要吸收场所。

2 锌的生物学功能

锌与机体内多种酶的活性有关，是酶的重要组成部分或激活因子。这些含锌金属酶分为氧化还原酶、转移酶、连接酶、水解酶、裂合酶和异构酶等，它们与机体蛋白质、糖类、脂类、矿物质和维生素等的代谢密切相关，参与基因的转录、翻译，细胞增殖、分化及细胞内信号传导，对动物生长发育和肠道保护具有重要的生理和营养意义[4]。锌耗竭试验证实，缺锌会导致仔猪平均日增重极显著降低，生长激素合成下降，生长激素结合蛋白表达减少，以及由生长激素诱导合成的胰岛素样生长因子1（IGF-1）合成减少，进而引起生长受阻[17]。研究发现，锌缺乏会导致皮肤胶原蛋白合成减少，随着饲粮锌含量的增加，胶原蛋白和角蛋白增加，上皮细胞层厚度增加，有利于皮肤抗损伤，因此，锌在胶原蛋白合成和上皮细胞增殖过程中发挥着重要的作用[18]。作为肾上腺皮质的固有成分，锌在垂体和性腺等处富集，参与垂体-促性腺激素-性腺等诸多过程的调节，从而影响性激素分泌及性腺活动，最终影响动物繁殖性能[19]。锌可通过参与氧化代谢相关酶类的组成，如Cu/Zn SOD，调节机体内的氧自由基的平衡，发挥抗氧化功能[20]。此外，锌在机体免疫功能扮演者重要的角色。研究发现，缺乏会引起胸腺和淋巴组织萎缩，导致动物免疫机能紊乱，引发复杂的免疫缺陷疾病，例如肠病性肢端皮炎，通过补锌可使机体恢复健康[21]。因此，锌与维持机体上皮完整性和生长发育、抗氧化、免疫和繁殖功能息息相关。

3 锌对断奶仔猪肠道屏障功能的影响

作为动物体内最大的消化、吸收和免疫器官，肠道参与营养物质的消化和吸收、维持电解质平衡，同时还是阻止病原微生物感染的第一道屏障，对于机体防御功能起着重要的作用。肠道屏障由物理屏障（细胞间紧密连接）、生物屏障（肠道微生物）、免疫屏障（细胞免疫和体液免疫）和化学屏障（分泌蛋白）组成，这四种屏障各自承担着不同的角色并结合在一起，抵抗外界有害物质对机体的侵袭[22]。当肠道屏障功能被破坏时，肠道微生物和内毒素突破肠道屏障防线，进入体内其他组织、器官和血液循环系统，引起肠原性感染[23]。

3.1 物理屏障

锌可以促进肠道的发育，改善肠道黏膜形态。Zhu 等（2016）[24]研究发现，饲粮添加3 000 mg/kg 氧化锌提高断奶仔猪十二指肠绒毛高度，降低隐窝深度，改善肠道黏膜形态。龙丽娜（2018）[25]研究指出，饲粮添加500 mg/kg多孔氧化锌或纳米氧化锌显著增加断奶仔猪空肠和回肠绒毛高度以及十二指肠、空肠和回肠绒隐比，降低十二指肠和空肠隐窝深度。Wang 等（2018）[26]同样发现，饲粮添加450 mg/kg 纳米氧化锌和3 000 mg/kg 氧化锌均可提高断奶仔猪小肠绒毛高度和绒隐比。有机锌上的研究表明，饲粮添加100 mg/kg 乳酸锌增加断奶仔猪肠绒毛高度，降低隐窝深度[27]；饲粮添加300 mg/kg 蛋氨酸锌降低仔猪小肠隐窝深度，提高绒毛高度，增加绒毛宽度，提高小肠二糖酶活性[28]。锌可以直接调节胃底腺细胞分泌胃饥饿素（Ghrelin）和小肠黏膜细胞IGF-1的分泌，促进消化道发育，进而缓解断奶对仔猪肠道带来的应激，提高生长性能[29]。同时，锌的添加可以上调断奶仔猪十二指肠、空肠和回肠TFF3（三叶因子3）和Nrf2（核转录因子2）的mRNA 表达水平[25]，这就提示锌可能通过调节TFF3、Nrf2和IGF-1的表达来影响肠道黏膜结构形态。

图1 锌对断奶仔猪肠道屏障功能的影响

体外试验研究发现，以人上皮细胞为模型，锌缺乏使结合于蛋白质上的锌释放出来，增加细胞质中的游离锌的含量，导致细胞生长受到抑制、紧密连接蛋白被破坏，最终肠道屏障功能受损[30]。同样地，Sarkar等（2018）[31]研究发现，缺锌会改变细胞旁离子电导，加剧细菌感染，紧密连接复合体因膜融合蛋白少而增宽，形态扭曲，同时Cl-分泌减少，由此说明缺锌破坏肠道完整性，导致肠道屏障功能紊乱和完整性改变，导致感染易感性。相反，添加锌减少氯化物的分泌[32]，增加细胞跨膜电阻[33]，维持细胞紧密连接完整性，改善肠道的屏障功能。锌离子能够使紧密连接蛋白Claudin-2和Claudin-4的重新分布，并通过细胞外信号调节激酶（ERK1/2）调节紧密连接蛋白的磷酸化状态缓解志贺氏菌病攻毒对肠道屏障造成的紊乱[34]。因此，机体需要足够的锌来维持肠道屏障的健康，以避免肠道感染的风险。体内试验研究发现，饲粮添加2 000～3 000 mg/kg 氧化锌可以通过提高肠道紧密连接蛋白Occludin 和ZO-1的基因表达改善断奶仔猪肠道的渗透性，维持肠道屏障功能完整性[35]。Pei等（2019）[36]研究同样指出，饲粮添加800 mg/kg 纳米氧化锌显著降低断奶仔猪血清中二胺氧化酶的活性，提高回肠黏膜中ZO-1 的基因表达。Shao 等（2017）[37]研究发现，锌能增强CACO-2 细胞的分化，并通过激活磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）信号通路来提高细胞之间的紧密连接蛋白ZO-1 的表达。由此可见，锌可能通过ERK 和PI3K/AKT/mTOR 信号通路影响细胞间紧密连接蛋白的重组和表达进而调控断奶仔猪肠道物理屏障功能。

3.2 免疫屏障

长期锌缺乏导致肠黏膜免疫屏障受损并伴随炎症细胞的浸润，特别是上皮多核淋巴细胞在肠道黏膜上的迁移失控，诱发黏膜损伤[38]。体外试验研究表明，氧化锌减少了大肠杆菌肠毒素处理诱导的CACO-2细胞中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的基因表达[39]。Sarkar 等（2019）[34]研究表明，锌离子能够降低白介素-6（IL-6）和白介素-8（IL-8）的蛋白水平，缓解志贺氏菌病攻毒引起的炎性反应。体内试验研究发现，锌可以促进肠道上皮细胞分泌型免疫球蛋白（SIgA）和炎性因子的分泌，增强肠道免疫力[40]。Yi等（2016）[41]报道，饲粮中添加3 000 mg/kg氧化锌提高空肠黏膜中转化生长因子-β（TGF-β）mRNA 表达，降低促炎细胞因子白介素-1β（IL-1β）和干扰素-γ（IFN-γ）mRNA 表达。饲粮添加800 mg/kg纳米氧化锌显著提高断奶仔猪回肠黏膜中IL-1β、IL-10、TNF-α和肿瘤增殖抗原（KI-67）的基因表达[36]。随着断奶仔猪饲粮中包膜氧化锌浓度的增加（100、200、400 mg/kg），空肠黏膜IL-10基因表达量呈线性增加，而IL-6 基因表达量呈线性降低[42]。此外，饲粮添加100 mg/kg 乳酸锌通过提高肠道黏膜金属硫蛋白1基因表达，诱导肠道黏膜组织C-反应蛋白（CRP）、触珠蛋白（HP）和α1 酸性糖蛋白（AGP）基因表达上调，增加仔猪的抗病能力[27]。综上，锌通过调控肠道炎性因子、分泌型免疫球蛋白和组织急性期蛋白维持仔猪肠道免疫屏障功能。

3.3 生物屏障

锌作为机体必需的微量元素参与体内蛋白质的合成同时也是宿主体内微生物定植和增殖所必需的矿物元素，因此，锌与肠道微生物息息相关。体外研究发现，氧化锌具有较强的杀菌作用，通过破坏大肠杆菌K88的菌体细胞膜，使内容物外泄致使细菌死亡[43]，同时还能抑制大肠杆菌对肠细胞的黏附，避免大肠杆菌对肠细胞的破坏[39]。仔猪肠道食糜中加入氧化锌抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的增殖[44]。然而，关于锌对仔猪肠道微生物影响的体内试验研究结果存在一定的差异。药理性剂量（3 042 mg/kg）氧化锌饲喂仔猪增加其肠道中兼性厌氧细菌的增殖，改变肠道微生物的丰度和多样性[45]。Ciesinski等（2018）[46]研究表明，高剂量氧化锌（2 013 mg/kg）增加仔猪肠道多耐药性大肠杆菌的数量。然而，Li等（2001）[47]发现日粮中添加3 000 mg/kg氧化锌对断奶仔猪肠道食糜中大肠杆菌、梭状芽孢杆菌和乳酸杆菌的数量均无显著影响。Wang等（2018）[26]用氧化锌和纳米氧化锌饲喂仔猪，结果发现饲粮添加450 mg/kg 纳米氧化锌显著降低断奶仔猪盲肠、结肠和直肠粪便中大肠杆菌的数量，而3 000 mg/kg 氧化锌对肠道食糜中大肠杆菌的数量无显著影响。Pei等（2019）[36]考察锌对断奶仔猪肠系膜淋巴结中微生物的影响，结果发现饲粮添加800 mg/kg纳米氧化锌显著降低断奶仔猪肠系膜淋巴结中总厌氧菌的数量。有机锌上的研究发现断奶仔猪饲喂100 mg/kg壳聚糖锌盲肠和结肠内容物中大肠杆菌和沙门氏菌的数量显著降低，而有益菌乳酸杆菌数量显著提高[48]。体内试验不一致的原因可能与锌的添加形式、添加量、动物的生理阶段和健康状况以及微生物检测本身的不稳定性有关。肠道内的有害菌可以通过黏附肠上皮细胞破坏肠黏膜上皮细胞的完整性，使肠道内有害物质及菌群通过血液进入体内进入循环，进而造成动物全身性感染而死亡。Roselli等（2003）[49]在体外试验中发现添加1 mmol/l氧化锌可以抑制大肠杆菌在CACO-2细胞的黏附。Broom等（2006）[50]同样发现添加高锌抑制细菌移位。因此，锌可能通过减少大肠杆菌等有害菌对肠上皮细胞的黏附和移位改善肠道的生物屏障功能，进而维持机体健康。

3.4 化学屏障

短期缺锌导致肠黏膜杯状细胞数量减少，黏膜蛋白含量降低，而长期缺锌使杯状细胞数量、面积和直径、黏膜厚度以及蛋白含量均降低，说明缺锌可引起肠道黏液分泌细胞的超微结构遭受损害[51]。在机体黏膜的化学屏障中，分泌蛋白作为其中重要的组成部分，锌会促进肠上皮细胞分泌抗菌肽[52]。抗菌肽LL-37 具有潜在的广谱抗菌活性，包括金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌和真菌等，补锌可以增加CACO-2细胞分泌抗菌肽LL-37，并且具有剂量效应[53]。猪抗菌肽PR-39对细菌、真菌有广谱抗菌能力，对病毒、原虫及癌细胞也有一定的作用，研究发现，断奶对仔猪PR-39 mRNA 表达有较大影响，断奶后仔猪腹泻率和死亡率高可能与抗菌肽表达下降有关，补充锌显著增加了仔猪断奶后15 d PR-39 mRNA 的表达[54]。由此可知，锌可通过调控肠上皮细胞分泌蛋白的表达进而维护其化学屏障功能。

4 高剂量锌的负面影响

锌缺乏会导致机体出现一系列的功能障碍，但急性或慢性的锌暴露，导致锌离子浓度过高也会产生极大的细胞毒性[8]。给予巴马猪药理剂量的硫酸锌（1 500 mg/kg）提高十二指肠和空肠Bcl 相关X 蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8（Caspase-8）的基因表达量，刺激细胞凋亡，导致肠道上皮损伤[55]。饲粮添加2 000 mg/kg碳酸锌显著降低仔猪采食量，同时出现胃炎、卡他性肠炎和肠系膜充血等各种症状[56]。体外试验研究发现，适宜剂量的氧化锌降低了CACO-2的通透性，而高剂量的氧化锌可能会对CACO-2细胞产生毒性，使通透性增加[49]。目前，畜禽饲粮中最常用的锌添加形式为高剂量无机锌，主要包括氧化锌和硫酸锌。高剂量无机锌易吸潮、生物学利用率极低，大量锌随粪便排出体外，造成资源的浪费，同时对环境造成极大的压力。Meyer等（2002）[57]研究表明日粮添加2 000～3 000 mg/kg氧化锌显著增加粪样中锌的排放量，是饲喂基础饲粮的33倍。Jondreville等（2003）[58]指出，以粪便作为肥料应用时，粪便中残留的锌会随着粪便进入土壤并蓄积，产生严重的金属毒性，这对周围植物的生长、土壤中的微生物和生态环境产生威胁。此外，在饲粮中添加4 000 mg/kg氧化锌会抑制其他微量元素的吸收，降低植酸酶的活性[59]。因此，长期使用高剂量锌不仅不利于仔猪健康，还加剧了生态环境的压力。

5 结语

锌作为必需微量元素，参与机体内多种酶的组成，对断奶仔猪肠道屏障功能具有重要的作用（图1）。高剂量氧化锌能有效控制仔猪腹泻，缓解断奶应激，但高锌的使用会给生态环境带来巨大的压力。目前，有关锌对肠道屏障功能保护作用的分子机制尚不完全清楚，在各种应激条件下的最佳添加来源、添加量和最佳投喂方式也研究甚少，锌对肠道微生物影响的研究结果不一致。因此，从肠道屏障入手，用分子生物学手段进一步研究锌源和锌水平对仔猪断奶应激缓解的作用机制，弄清锌对肠道微生物的调控途径，有利于寻找高锌替代物，缓解生产和生态之间的矛盾，提高经济效益。