广东湛江竹节树自然种群遗传结构及遗传分化

郑志翰，肖 兰，2，杨盛昌

(1.厦门大学环境与生态学院，福建 厦门 361102； 2.自然资源部海岛研究中心，福建 平潭 350400)

竹节树(Caralliabrachiata(Lour.) Merr.)是一种陆生红树科(Rhizophoraceae)木本植物，主要分布在我国广东、海南、广西、台湾等水热较为充沛的地区。竹节树在景观绿化方面应用广泛，有较强的降噪、抗污染、防火和水源保护等能力，经济价值较高，因此竹节树野生资源易遭到人为破坏，造成自然种群衰退，甚至在部分地区面临消失殆尽的风险。

相较于潮间带红树科植物，有关竹节树的研究较少，且主要集中在栽培育种、资源生态、生理生化、生长发育等方面[1-4]，涉及分子遗传及种群生态学方面的研究更为缺乏。Kazuo O等[5]发现竹节树染色体数目为2 n=112，但王瑞江等[6]认为竹节树染色体数目为2 n=48。黄建辉等[7]则认为竹节树与非竹节树类红树科植物之间遗传差距较大。

种群的空间遗传结构是指种群中基因型非随机性的空间分布[8]，地理分布特点、繁殖体传播方式等是种群空间遗传结构形成的主要原因。成熟植物个体因无法自由活动，花粉和种子散布过程受到一定的空间限制，因此空间遗传结构在植物种群内普遍存在[9]，通常地理距离近的个体间遗传相似度高于较远距离的个体[10]。基因流为生物种内或种间基因的传递和交换[11]，主要通过花粉和繁殖体等遗传物质携带者的传播来实现。本文以广东湛江竹节树自然小种群为研究对象，采用SSR遗传标记的方法研究其遗传变异及空间遗传结构，为阐述竹节树种群的动态变化及适应机制提供分子生态学信息，同时为其保护和管理提供参考。

1 实验材料与方法

1.1 样地及实验材料

样地位于广东省湛江市高桥镇(21°35′N、109°45′E)，为典型的亚热带季风气候，年均温23.3 ℃，年均降水量1723 mm。样地面积约40 hm2，自然生长的竹节树密度约0.925株·hm-2，呈零星分布，生长良好，为代表性的植被种类之一。

由前期调查发现此样地共有竹节树29株，其中成年植株21株、小树8株，此外还有幼苗若干。根据地理分布特点，将竹节树种群分成红寨、排坡、垌心及江背4个亚种群。2016年6月，对样地内29株竹节树进行叶片采集，4个样地的样品编号分别为：红寨1～红寨9、排坡1～排坡5、垌心1～垌心13、江背1～江背10；同时，为研究竹节树种群基因流，随机采集8株幼苗的叶片(表1)。测量并记录每株的GPS坐标、株高、胸径(基径)、冠幅等地理、形态学特征。

表1 竹节树样品基本信息

1.2 实验方法

1.2.1 DNA的提取与鉴定 利用天根DP321-03快速提取试剂盒制备竹节树基因组，采用紫外分光光度法测定其浓度和纯度。

1.2.2 引物与PCR反应体系 本研究所用引物筛选自秋茄(Kandeliaobovate)[12-14]、白骨壤(Avicenniamarina)[15-16]、榄李(Lumnitzeraracemosa)[17]。从33对引物中筛选得到核基因组nSSR引物7对、叶绿体基因组cpSSR引物2对，共9对引物用于PCR反应(引物信息见表2)。

经琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增出的产物，委托生物工程(上海)股份有限公司进一步进行毛细管电泳，检测条带大小。为便于检测，引物合成时，在F端添加荧光标记。

1.3 数据处理和分析

1.3.1 种群遗传多样性 利用GenALEx 6.4计算竹节树种群的遗传多样性参数，并利用GenePop软件进行Hardy-Weinberg(HWE)平衡检验。

1.3.2 种群遗传分化 利用GenALEx 6.4的AMOVA方差分析评估亚种群间的遗传分化大小。利用GenALEx 6.4进行主成分分析(PCoA)，利用Structure软件进行分组分析。

1.3.3 亲本分析及基因流 基于nSSR引物扩增出的条带情况，使用Cervus 3.07软件分析8个幼苗的可能父本及母本，并通过坐标计算种子流和花粉流大小，其中种子流为幼苗与潜在母本间的距离，花粉流为幼苗潜在的父母本间的距离。

1.3.4 小尺度空间遗传结构 利用SPAGeDi 1.5分析样地所有区域亚种群的空间遗传结构。

表2 引物信息表

2 结果与分析

2.1 种群遗传多样性

竹节树种群的遗传多样性检测结果见表3。竹节树种群的Shannon′s多样性指数(I)平均值为1.437，观测杂合度(Ho)为0.436，期望杂合度(He)为0.607。7对nSSR引物平均扩增出等位基因(Na)9.29个。

表3 竹节树种群整体遗传多样性

对4个亚种群进行HWE平衡检验，除了Kaca01之外，其他位点都存在显著偏离HWE平衡的现象。其中，杂合子缺失占多数，仅有江背的Kaca04位点存在杂合子过剩。Kcan034、AM98、Lumr28 3个位点均为杂合子缺失。

2.2 种群遗传分化

图1 竹节树种群主成分分析结果

对红寨、排坡、垌心、江背竹节树4个亚种群进行遗传分化分析，亚种群间Fst在0.088～0.181范围内，整体Fst=0.130(P=0.05)，亚种群间的遗传分化显著。竹节树种群的遗传变异主要来源于亚种群内(80%)，亚种群间的遗传变异仅占20%。

主成分分析表明，在竹节树种群中，垌心亚种群与红寨亚种群、江背亚种群能较为明显地区分开，而红寨亚种群与江背亚种群二者之间略有重叠；排坡亚种群则与另外3个亚种群混合在一起(图1)。

竹节树分组分析结果(图2)表明，种群中存在2个种源——type1和type2。type1主要分布在红寨和排坡的亚种群中，这2个亚种群的遗传背景较为简单；而垌心和江背种群遗传背景比较复杂，以type1、type2混杂的种源及type2优势种源为主，并与红寨、排坡种群之间遗传分化明显，在一定程度上反映了两者在祖先种源上的遗传背景差异。

图2 竹节树种群的Structure分析

图3 竹节树亚种群单倍型组成及占比

采用cpSSR引物分析发现，竹节树种群存在3个单倍型(Haplotype)(图3)，在不同的亚种群中有不同分布。红寨亚种群和江背亚种群有3个单倍型，排坡仅有单倍型1，垌心则有单倍型1和单倍型2。其中红寨亚种群中以单倍型2为主，占比达到66.67%，另外2种单倍型较少；江背亚种群以单倍型2和单倍型3为主；垌心亚种群有单倍型1和单倍型2，且占比相当。可能竹节树种群的祖先以单倍型1为主，之后有其它基因源流入种群，也有可能4个亚种群最初种源不同。

2.3 亲本分析及基因流

由于Kcan034位点无效等位基因频率较高，在亲本分析时剔除该位点。基于其余6个位点的幼苗亲本分析(表4)表明，5株幼苗可以找到潜在亲本。幼苗3和幼苗8可以找到潜在双亲，其具有共同的潜在亲本江背1和江背4，且两潜在亲本具有相同的cpDNA，推测与幼苗1、8地理距离较近的江背4为母本，江背1为父本[18]。在亲本分析的基础上，测算竹节树种群种子流为50.13～186.36 m，平均值为131.78 m；花粉流为289.64 m。

表4 待测幼苗的潜在亲本分析

2.4 小尺度空间遗传结构

图中虚线以外为95%置信区间图4 竹节树种群亲缘关系系数图

亲缘关系系数可以反映小种群空间遗传结构(图4)。在竹节树种群中，4.41～7.00 m范围内有显著空间遗传结构，亲缘关系系数在间隔为6 m时最大，7 m以后则呈随机分布的状态。竹节树种群空间遗传结构强度sp=0.041。其短距离的空间遗传结构或与种子的集群分布有关。

3 讨论

3.1 种群遗传多样性与Hardy-Weinberg 平衡

王伟等[19]研究了广东广州的木棉种群，发现Ne≤3.159，He=0.418，I=0.687；曾淇等[20]对广东、海南荔枝种群的研究表明，Na=2.400，He=0.355。显然，与人工植物种群相比，天然的竹节树种群具有较高的遗传多样性。

在红树科潮间带植物种群中，Sandoval-Castro等[21]发现美洲正红树(Rhizophoramangle)Ho=0.160、He=0.170；Islam等[22-23]发现日本主要红树植物红海榄(Rhizophorastylosa)Ho=0.130、He=0.338，秋茄Ho=0.123、He=0.252，木榄(Bruguieragymnorrhiza)Ho=0.314、He=0.408；葛青萍等[24]采用同工酶技术发现我国3个木榄种群Ho平均值为0.271，He平均值为0.268。比较而言，陆生竹节树种群遗传多样性(Ho=0.436，He=0.607)处于较高水平。可能潮间带的红树科植物由于生境较为一致，普遍面临潮汐淹水和高盐等胁迫的影响，潮间带生境对特定基因有较强的选择作用，导致遗传多样性水平较低。而竹节树种群生存的陆生生境具有局部复杂性，在进化过程中保留下来的基因更加多样，因而竹节树种群会有较高的遗传多样性。

竹节树种群在大多数位点上显著偏离HWE平衡，并且为杂合子缺失。基于各位点的等位基因频率进行的瓶颈效应检测，发现竹节树种群并不存在瓶颈效应，可以排除瓶颈效应对HWE平衡的影响。推测竹节树种群偏离平衡的原因可能有以下2点：①竹节树种群是个小种群，仅有37个个体，使得种群的基因频率发生随机偏差，偶然性较大[25]；②砍伐及移除等人类活动可能导致竹节树自然种群受到影响。

3.2 种群遗传分化

Wright[26]认为，当生物种群遗传系数大于0.125时，有较大的遗传分化程度，据此，可认为竹节树种群遗传分化程度较大。研究发现，日本西表岛红海榄种群Fst在0.020～0.695之间，秋茄种群Fst在0.028～0.667之间，木榄种群Fst在0.000～0.302之间[22-23]。因此，陆生竹节树种群遗传分化程度低于潮间带红树科植物种群，其原因可能是竹节树种群分布面积较小，不同亚种群间地理距离较近，地理分化不明显。

从基因组角度考虑，竹节树种群初始种源较为单一，但不同亚种群间种源的组成差别较大。究其原因，可能与不同亚种群的种源不同有关，同时也可能与不同亚种群间经受的选择压力不同有关，如生境的异质性和人为活动(砍伐、移栽等)的影响导致不同亚种群出现分化。总体来看，竹节树种群中以type1种源为主，该种源可能是竹节树种群初始核基因组单倍型。从叶绿体基因组来看，排坡种群只由单倍型1组成，并且单倍型1在4个亚种群中均有分布，表明单倍型1是竹节树种群的最早单倍型。不同的单倍型也可能来自于不同的外部种群。竹节树种群个体得到补充，一定量持续稳定的基因流可以弥补遗传风险引起的个体丧失，维持甚至于增加小种群的数量规模并保存其遗传多样性和适合度[27]。

3.3 花粉流及种子流

有研究表明，海南三亚铁炉港正红树植物种群的种子流为20.0 m(1.2～62.2 m)、花粉流为32.8 m(18.1～60.1 m)[28]，很明显，陆生竹节树种群有较大的种子流和花粉流。可能植物种群密度与植物种子流、花粉流大小关系密切，本研究中，竹节树种群密度较小，分布零散，地形的起伏有利于花粉及种子的长距离传播。此外，现场发现，一种鹎鸟会以竹节树浆果为食，并携带至较远的位置，这可能是竹节树种群有较大种子流的原因之一。阮咏梅等[29]研究发现，湖北省黄梅县龙感湖自然保护区内黄梅秤锤树(Sinojackiahuangmeiensis)的花粉流为23.81 m(0～126.07 m)，种子流为9.07 m(0.22～91.18 m)；热带榕属植物(Ficusdugandii)种群花粉流可达14.20 km(10.90～16.90 km)，Ficusobtusifolia种群花粉流可达5.80 km(5.20～6.40 km)[30]。在一定程度上，植物种群大小、分布特征及地形因素等是导致陆生植物种群间基因流差别较大的原因所在。竹节树种群的花粉流(289.64 m)大于种子流(131.78 m)，共同构成了植物种群的基因流[31-32]。

3.4 种群小尺度空间遗传结构

黄梅秤锤树种群在10 m内有显著的空间遗传结构[29]。潮间带白骨壤种群有无遗传结构取决于其地理位置与种群结构，如三亚铁炉港白骨壤种群在0.0～24.0 m范围内有显著的空间遗传结构，而云霄白骨壤种群不具有显著的空间遗传结构[28]。本研究中，竹节树种群在4.4～7.0 m范围内有显著空间遗传结构，可能与种子就近散布有关。竹节树种群的显著空间遗传结构表明其能维持正常的繁殖和生态适应。

4 结论

广东省湛江市高桥镇的自然竹节树种群有较高的遗传多样性及显著的遗传分化，Fst=0.130。其花粉流和种子流分别为131.78 m和289.64 m。在4.4～7.0 m的范围内，竹节树种群有显著的空间遗传结构。从目前状况来看，该种群尚处于健康和稳定的状态，但应加强保护和管理，以避免更多的人为干扰和破坏导致竹节树种群资源的衰退甚至消亡。

*：感谢马益超协助进行野外调查及采样，感谢邹祯、杨慧和黄含玥在实验开展以及数据处理上给予的帮助。