基于网络药理学探寻银芩口服液治疗新型冠状病毒肺炎抑制机制的研究

季士亮，何丽萍，郭东凯，王 威，陈 辉，江翊国，王 诚＊

1.南京医科大学附属苏州科技城医院临床药学实验室（江苏苏州 215153）

2.苏州市天灵中药饮片有限公司（江苏苏州 215000）

3.西南医科大学药学院（四川泸州 646000）

2019年在我国湖北武汉新发的冠状病毒是一种新型冠状病毒（SARS-CoV-2），其引起的新型冠状病毒肺炎（Corona virus disease 2019，COVID-19）给我国和世界其他国家均造成了严重灾难。截止2020年7月1日，国外确诊人数为1 100多万，死亡病例530 000多例，我国确诊人数为85 000多例，死亡病例4 600多例。该病毒具有潜伏期长、传染性强、各类人群普遍易感等特点，感染初期以发热、乏力、干咳为主要临床表现，严重者出现多器官衰竭，目前尚无特效药[1]。

由于尚未研制出抗SARS-CoV-2的特效药及疫苗，然而几千年来中医药在应对各种疫病的治疗中都发挥了积极的作用，尤其近年来在SARS、H1N1流感病毒等防治中，中医药也发挥了重要作用[2-3]。国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》中，不断强调加强中西医结合诊疗COVID-19 模式的构建[4]。我国疫情能得到很好的控制，中西医结合治疗的模式得到了国外医学者越来越多的重视，同时我国也向全世界积极共享中医药在抗击新冠疫情中的宝贵经验。

银芩口服液（原金蝉口服液：苏药制字Z04001335）复方主要由金银花、黄芩、柴胡、蝉衣等提取物制成的中药制剂，具有疏风解表、清热解毒的功效，临床主要用于感冒、发热、咽痛等上呼吸道感染，另外，长期的临床实践表明其治疗手足口病和小儿合胞病毒感染效果尤为突出[4]。该处方根据中医药理论，柴胡苦平，入肝胆经，透泄与清解少阳之邪，并能疏泄气机之郁滞，使少阳之邪得以疏散，黄芩苦寒，清泄少阳之热，柴胡之升散，得黄芩之清降泄，两者配伍，达到和解少阳的目的。同时处方中的金银花、黄芩、柴胡在COVID-19诊疗中是高频使用的中药[5]。

网络药理学和分子对接综合了多个学科，能综合的分析药物-疾病-基因-靶点之间的关系，具有“多基因、多靶点”的特点[8]。分子对接作为网络药理学中预测中药有效成分靶点的关键技术，具有高效、经济的特点，现已广泛应用于中医药领域中[9]。本研究通过计算机辅助药物设计对主要活性成分与新型冠状病毒肺炎关键靶标蛋白进行模拟研究，通过网络药理学筛选出银芩口服液作用靶点进行聚类分析，为银芩口服液抗新型冠状病毒的药物开发和临床治疗提供参考。

1 方法

1.1 银芩口服液中成分收集与靶点的获取

根据复方中单味药的拼音名称从数据库Traditional Chinese Medicine Systems P harmacology Database and Analysis Platform（TCMSP，网址为：http://tcmspw.com/）[10]和a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine（BATMAN-TCM，网址为：http://bionet.ncpsb.org/ batman-tcm/）[11]，分别检索银芩口服液各单味药的化学成分。以OB≥30%，DL≥0.18为标准在TCMSP数据库中收集“金银花”“黄芩”“柴胡”“蝉蜕”的有效活性成分以及对应靶点。

1.2 靶点蛋白基因名的转换及靶点蛋白网络构建

本研究先将化合物作用靶点通过蛋白质数据库 UniProt（https://www.uniprot.org/）转换成对应的基因名称，再利用人类基因数据库GeneCards（https://www.genecards.org/）查询靶标蛋白对应的基因名，并通过Cytoscape3.7.2（http://www.cytoscape.org/） 构建药材-化合物-靶点网络，分析化合物和靶点互作网络。

1.3 蛋白互作网络构建及聚类富集分析

采用Metascape[12]（http://metascape.org/，veision 3.5）对银芩口服液的靶点进行分析。通过BioGrid, InWeb_IM, OmniPath三个数据库获取靶点蛋白-蛋白相互作用信息并构建蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）网络。采用Molecular Complex Detection （MCODE）算法将靶点进行聚类，并对其进行GO生物过程分析、GO分子功能分析、GO细胞成分分析，然后根据靶点数量对结果进行排序，保留排名前5位结果。

1.4 核心靶点通路分析

为了明确银芩口服液核心靶标的功能及在信号通路中的作用，利用R软件的ClusterProfiler包，设定阈值P＜0.01，进行KEGG信号通路富集分析，得到银芩口服液活性化合物作用靶点的主要生物功能和通路过程，并利用可视化在线绘图网站Omishare（tools/index.php/）绘图。

1.5 成分-靶点分子对接

首先，通过Pocasa数据库预测活性对接靶点，每个蛋白选择排名前五的活性位点，进行对接。从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）[13]下载新型冠状病毒的水解酶蛋白 3CLLpro（PDB ID：6lu7）和 ACE2（PDB ID：1r42）的分子结构 PDB 格式文件。运用PyMOL软件分离原配体，并使用AutoDock 软件处理蛋白和药物小分子，保存为pdbqt，并进行分子对接。一般认为结合能小于0则配体与受体可以自发结合，本研究筛选自由能小于-5的结果。将与小分子对接中5个活性蛋白位点中最小的结果使用pymol进行处理，最终筛选出与新冠病毒靶点最相关的化合物。

2 结果

2.1 活性化合物的筛选

从TCMSP中检索发现，银芩口服液共含有56个活性成分，对应不同的靶标266个。其中，黄芩31个，金银花17个，柴胡11个，蝉蜕3个。值得注意的是，银芩口服液中存在不同中药含有相同成分的现象。通过venny2.1.0将成分交集结果可视化（见图1），得到5个共有成分：山奈酚和槲皮素为柴胡和金银花所共有；β-谷甾醇和黄烷酮为黄芩和金银花所共有;豆甾醇为柴胡、金银花和黄芩三者所共有。银芩口服液活性成分具体信息见表1。

图1 银芩口服液中成分分布Figure 1.Distribution of compounds in YQOL

表1 银芩口服液主要活性成分Table 1.The main active components in YQOL

表1 银芩口服液主要活性成分Table 1.The main active components in YQOL

2.2 化合物-靶点互作网络

将关键靶点导入Cytoscape 3.7.2软件构建YQOL靶标网络图（图2），网络模型中共有312个节点，726条连接。根据拓扑学分析结果，该网络中，节点连接度平均值为12.9，每个靶点平均与2.8个成分相互作用。经过 Degree 打分排序，采用“Degree＞2倍中位数，BC＞中位数，CC＞中位数”为筛选标准，得到12个核心成分，被认为是银芩口服液起效的关键所在，其中靶点数目最多的前7个化学成分分别是M1-槲皮素、M2-异黄碟呤、M3-山柰酚、M4-豆甾醇、M5-β-谷甾醇、M6-木犀草素、M7-黄芩素，分别能与154、127、68、39、32、28、19个靶点蛋白发生相互作用。从靶点来看，排名前5位的分别是PTGS1、ESR1、AR、PPARG、GSK3β，它们分别能与50、45、36、33、29个化合物发生相互作用。

2.3 蛋白互作网络构建及聚类富集分析

将 Metascape（http://metascape.org/,veision3.5）中蛋白相互作用网络（PPI）和聚类分析的结果可视化（图 3）。PPI网络由共226个节点，930条边组成，节点的大小用degree表示，不同的颜色来表示不同的模块。MCODE聚类分析结果中，涉及 12个模块，89个靶点。对上述模块进行GO富集分析，根据靶点数目与模块总靶点数的比值（靶点占比）进行排序，保留靶点占比靠前的 3个生物过程、分子功能、细胞成分结果。GO功能富集得到237个生物过程、59个细胞组成、62个分子功能（见图 4）。

2.4 银芩口服液抗SARS-CoV-2靶点的通路分析

通过KEGG通路富集得到66条信号通路，主要有网络神经信号传递通路、肿瘤相关通路、cAMP信号通路等，其中网络神经信号传递通路涉及ADORA3-GRIK1-GABRB3-GABRB2-TACR2-GRIK2；肿瘤相关通路涉及PIK3CG-AR-BCL2-GSK3β-HIF1A；cAMP信号通路涉及ADCY3-CAMK2G- NFKBIA-GRIN2-RELA-MAPK8，见图5。

图2 银芩口服液中化合物-靶点网络Figure 2.The target network diagram of the compound of YQOL

图3 银芩口服液作用靶点的蛋白互作网络 (A) 和聚类分析 (B)Figure 3.Protein-protein interaction network (A) and MCODE analysis (B) for potential targets of YQOL

图4 银芩口服液作用靶点GO生物功能富集分析图Figure 4.GO biological enrichment analysis diagram of YQOL action targets

图5 银芩口服液作用靶点KEGG 通路富集分析图Figure 5.KEGG pathway of YQOL action targets

2.5 银芩口服液中核心活性与ACE2 和 3CL水解酶的分子对接

一般认为，分子对接结合自由能越小越好，通过多次对比分子对接结果，得出银芩口服液中核心活性化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶、ACE2 有较好的结合活性，分子对接亲和力均远远小于-5.0 kJ/mol，结果见图6。

图6 银芩口服液中核心活性与ACE2 和 3CL水解酶的分子对接Figure 6.Molecular docking of ACE2 and 3CL hydrolase with YQOL bioactive ingredients

3 讨论

本研究采用网络药理学方法系统分析了名医名方银芩口服液对 COVID-19 的潜在治疗机制。从现存中药数据库获得了较为全面的化学成分和靶标信息，构建并分析中药-归经网络、靶标网络模型，结果显示中药复方银芩口服液治疗COVID-19是通过多成分协同起效、多靶点共同发挥抗SARS-CoV-2作用，为探索银芩口服液抗SARS-CoV-2的药物开发和临床治疗提供参考。根据中医理论，COVID-19属中医疫病范畴，病因为感受“疫戾”之气，疠气病因是导致瘟疫暴发的致病因素，基本病机特点为“湿、热、毒、瘀”，强调根据发病不同地点、不同阶段、因人辨证论治，治疗初期应以清热化湿解毒为主[7]。经方中金银花辛凉透表，清热解毒，又具芳香辟秽的功效。蝉蜕质轻上浮，善行上焦气分。黄芩清泄肺火，柴胡发汗解表，四药合用，宣降并施，发表透邪，清热解毒，温邪无可藏匿，逐外散而病愈[12]。银芩口服液集清热解毒、芳香化湿降浊于一体，但其用于COVID-19的治疗尚缺少直接证据。笔者认为，应在当地现有疑是及确诊患者中积极开展多中心循证临床研究。

由于SARS-CoV-2 是新发现的病毒，目前尚未研制出特效药，虽然国外有研究称抗病毒药瑞德西韦对COVID-19疗效显著[13]，但该药尚未在任何国家批准上市，其安全性和有效性也未被证实。而数千年来中医药在我国应对各种疫病中都发挥着重要作用，本次疫情期间国家卫生健康委多次强调中西医联合防治COVID-19 的中国模式，并取得了巨大成效。2020年2月24日北京市新型冠状病毒肺炎疫情防控工作新闻发布会报道，北京COVID-19中医药治疗率总体为87%。在中医药治疗患者中，使用中药汤药的比例82%，中医药治疗总有效率为92%。中医药在我国COVID-19的防治中起到了重要作用，中西医结合治疗的优势再次显现[14]。

目前研究已证实ACE2（羧肽酶生成血管紧张素II）是病毒打开宿主细胞的“钥匙”，降低ACE2的表达可以达到阻止病毒进入细胞的作用[15]。因此，本研究通过网络药理学对银芩口服液复方成分进行网络分析，并利用分子对接将银芩口服液中核心活性化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶进行对接及与病毒表面受体ACE2酶进行对接，从而筛选银芩口服液中对抗COVID-19的活性成分。研究发现银芩口服液中前20个活性化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶的结合能较为接近，尤其是黄芩素和异黄蝶呤。由于ACE2是2019-nCoV进入宿主细胞的关键表面受体，对冠状病毒的感染和传播能力起着重要作用。所以再次将银芩口服液核心活性成分黄芩素和异黄蝶呤与ACE2进行了分子对接，研究发现黄芩素和异黄蝶呤与ACE2亲和力远高于瑞德西韦。靶点网络图显示银芩口服液治疗COVID-19主要集中在PTGS1、GSK3β、NCOA2、ESR2、ESR1等核心靶点，且大多数与炎症反应相关。其中PIK3CG、PTGS1和GSK3β是与肺部最相关的通路基因。PIK3CG、PTGS1和GSK3β等靶点在抗病毒及在治疗肺炎的过程中有重要作用。

综上所述，银芩口服液在治疗SARSCoV-2抑制机制中具有多靶点、多通路的优势。但中药的药效不是其所含化学成分的简单加和，中药网络药理学研究中通常忽略中药成分的含量，但含量、浓度对药效的影响不可忽视[16]。因此，只有将基于网络的计算预测和实验确证相结合，对网络药理学的预测结果进行生物学实验，才能验证预测结果的准确性和可靠度。