养阴扶正方对PD-L1+Lewis肺癌细胞凋亡影响及作用机制

孙玺媛， 陈宏， 姜梅， 魏冬梅， 尹钢， 陈沫岚， 刘玲玲， 张杰

齐齐哈尔市第一医院暨南方医科大学附属齐齐哈尔医院，黑龙江 齐齐哈尔 161000

程序性死亡分子1（programmedcelldeath1，PD-1）及其配体程序性死亡分子配体1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）在肿瘤细胞免疫逃逸中发挥重要作用，是肺癌发生发展的机制之一，伴随PD-1/PD-L1抗体在肺癌中的广泛应用，使肺癌患者的无病进展生存期、总生存期得到了延长。PDL1 在肿瘤细胞高表达与T 细胞表面的PD-1 结合，使T细胞失能、耗竭，肿瘤细胞逃避T细胞的免疫监视和杀伤，进而增殖，病情恶化。肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡受细胞周期的调控[1]。养阴扶正方为临床经验总结方，由《温病条辨》中的沙参麦冬汤化裁而来，具有益气养阴、化痰通络、散瘀解毒的功效。经过十余年的临床使用，表明养阴扶正方能够改善非小细胞肺癌患者的临床症状、生存质量和稳定瘤灶，基础研究也证明其具有明确的抗肺癌的作用[2-5]。因此，本研究应用免疫磁珠筛选PD-L1+Lewis 肺癌细胞，经过流式细胞术验证后，建立移植瘤模型，研究其与原代Lewis 肺癌细胞在细胞凋亡以及细胞周期的差异及养阴扶正方的调控作用，为养阴扶正方的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞与动物

Lewis 肺癌细胞株：购自美国ATCC 公司；C57BL/6 小鼠，雄性，48 只，鼠龄6 ～8 周，20 ±2 g/只，SPF 级，购于青岛实验动物中心（证书编号：SCXK 2014-0001），实验动物使用许可证：SYXK（黑）2016004，本实验通过《齐齐哈尔市第一医院实验动物管理办法（试行）》伦理审核，伦理编号为NO.2018-01。

1.1.2 药品

养阴扶正方由黄芪、党参、沙参、天冬、麦冬、生白术、山药、白花蛇舌草、拳参、绞股蓝、茯苓、莪术组成，取以上药加水煎煮二次，每次加10 倍量水，提取2 小时，滤过后合并滤液，制成5.25 克（生药）/ml，以上药品由齐齐哈尔市第一医院试剂室提供。 阿特珠单抗（Atezolizumab，PD-L1 抑制剂）购自于美国基因工程技术公司。

1.1.3 试剂与仪器

细胞凋亡检测试剂盒（批号：WLA001a）、细胞周期检测试剂盒（批号：WLA010a）、全蛋白提取试剂盒（批号：WLA019）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：WLA004）、SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒（批号：WLA013）、SDS-PAGE 电泳液（干粉）（批号：WLA026）、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（批号：WLA005）、Bax antibody（批号：WL01637）、Bcl-2 antibody（批号：WL01556）、脱脂奶粉（批号：Q/NYLB 0039S）、羊抗兔IgG-HRP（批号：WLA023）、内参抗体β-actin（批号：WL01845）。

流式细胞仪（美国艾森生物公司）、Fresco低温冷冻离心机、MultiSkan3酶标（Thermo公司）；Mini P-4 电泳槽、湿转电泳槽（Cavoy）；分光光度计（Therno scientific）；凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；荧光定量PCR仪（Applied Biosystem）。

1.2 方法

1.2.1 PD-L1+Lewis 肺癌及Lewis 肺癌荷瘤鼠模型的建立

体外培养Lewis 肺癌细胞系，待细胞至增殖期，应用免疫磁珠分选出PD-L1+Lewis 肺癌细胞系。将PD-L1+Lewis 肺癌细胞系及Lewis 肺癌细胞系分别传代培养，将密度为2×107个/L 的PD-L1+Lewis 肺癌细胞悬液及Lewis 肺癌细胞悬液分别接种于小鼠右侧腋窝皮下（0.2 ml/只），分别构建PDL1+Lewis 肺癌/Lewis 肺癌荷瘤鼠模型。接种10 d后，待皮下移植瘤长至1 cm3左右，剥取1 只皮下移植瘤行病理检测均为癌细胞，说明造模成功。

1.2.2 实验分组

将造模成功的荷瘤鼠按随机数字表法分为以下8 组，每组6 只。PD-L1+Lewis 肺癌荷瘤鼠分组：模型组（Control 1 组）、PD-L1 抑制剂组（阿特珠单抗，ATZ组）、养阴扶正方组（YYFZD组）、联合组（养阴扶正方+阿特珠单抗，ATZ+YYFZD组）。Lewis 肺癌荷瘤鼠分组：模型组（Control 2组）、PD-L1抑制剂组（阿特珠单抗，ATZ组））、养阴扶正方组（YYFZD 组）、联合组（养阴扶正汤+阿特珠单抗，ATZ+YYFZD组）。

1.2.3 给药方式

1.2.3.1 模型组（Control 1组、Control 2组） 0.2 mL生理盐水灌胃，共10 d，第1 d、3 d、5 d 0.4 mL生理盐水腹腔注射。

1.2.3.2 PD-L1 抑制剂组（ATZ 组） 0.2 mL 生理盐水灌胃，共10 d，第1 d、3 d、5 d 0.4 ml阿特珠单抗（60 mg/kg）腹腔注射。

1.2.3.3 养阴扶正汤组（YYFZD 组） 0.2 ml养阴扶正汤（52 g/kg/d）灌胃，共10 d，第1 d、3 d、5 d 0.4 mL生理盐水腹腔注射。

1.2.3.4 联合组（ATZ+YYFZD 组） 0.2 ml 养阴扶正汤（52 g/kg/d）灌胃，共10 d，第1 d、3 d、5 d 0.4 ml阿特珠单抗（60 mg/kg）腹腔注射。

1.3 流式细胞术检测肺癌细胞调亡

停药第2日颈椎脱臼处死各组荷瘤小鼠，无菌剥取瘤组织，PBS冲洗，制成单细胞悬液，分别收集每组细胞至离心管中，4 ℃下离心2 000 r/min 离心6 min，用预冷的PBS 洗涤细胞3 次，低温下离心5 min，弃上清后加入结合缓冲液Bingbuffer重悬细胞，调整细胞浓度为2×105个细胞，加入5 ul膜联蛋白V-FITC（AnnexinV-FITC）结合液轻轻混匀，在室温下避光孵育10 min，加入5 ul碘化丙啶染色液，置于冰上遮光反应15 min，转入流式细胞仪进行上机检测，分析各组肺癌细胞凋亡率。

1.4 流式细胞术检测肺癌细胞周期。

将1.3 制成的单细胞悬液，调整细胞浓度1 ×106/ml，1 000 g，5 min ，沉淀细胞加入1 ml 70%的冷乙醇固定2 h至过夜，染色前用预冷的PBS 洗去固定液。加入100 μl RNase A，37 ℃水浴30 min，加入500 μl 碘化丙啶染色液混匀，4 ℃避光30 min。流式仪检测分析记录激发波长488 nm 处红色荧光。荧光信号变成电信号输出至计算机，荧光染料与细胞DNA 特异性结合，检测出细胞周期各个时像细胞比例。

1.5 Western-blot检测瘤组织中Bcl-2、Bax的表达

瘤组织匀浆，抽提组织蛋白，测定蛋白浓度，加入电泳缓冲液，混匀，100 ℃煮沸5 min，每个样分别取25 ug 上样，4% ～10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，转印至PVDF 膜，50 g/L 脱脂奶粉室温封闭1h 后加入相应一抗，4℃孵育过夜，PBS-T 洗涤3 次，每次5 min，分别加入羊抗兔或羊抗鼠二抗室温孵育2 h，PBS-T 洗涤3 次，每次10 min，ECL 显影，以目的蛋白与内参蛋白βactin 光密度的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.6 RT-PCR检测瘤组织中Bcl-2、Bax的基因表达

①提取样本总RNA。②紫外吸收测定法检测浓度和纯度，RNA的纯度在1.8～2.2之间。③逆转录合成cDNA。④将所有cDNA 样品分别配置Realtime PCR 反应体系。体系配置如下：2×Master Mix10 μl，10 uM 的PCR 特异引物F0.5 μl，10 uM的PCR 特异引物R0.5 μl，加水至总体积为18 μl，轻弹管底将溶液混合，5 000 rpm 短暂离心。⑤加样：a将18 ul混合液加到96-PCR 板对应的每个孔中。b. 再加入对应的2 μl cDNA。c. 小心粘上Sealing Film 封口膜，并短暂离心混合。d.在设置PCR 程序前将准备好的PCR 板放在冰上。⑥将上述96-PCR 板置于Realtime PCR 仪上进行PCR 反应。按以下程序进行：95℃，30 秒；40 个PCR 循环（95 ℃，5 秒；60 ℃，40 秒）。为了建立PCR 产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按95 ℃，10秒；60 ℃，60秒；95 ℃，15秒进行延伸；并从60 ℃缓慢加热到99 ℃（仪器自动进行-Ramp Rate 为0.05 ℃/秒）。⑦各样品的目的基因和内参分别进行Realtime PCR 反应，每个样本检测3个复孔。数据采用2-△△CT法进行分析。

2 统计分析

3 结果

3.1 养阴扶正方对PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌细胞凋亡的影响

如表1、图1 所示，Control 1 组凋亡率（88.35±1.64）%，Control 2 组凋亡率（87.16±1.85）%，两组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；在PD-L1+Lewis 肺癌中，与Control 1 组凋亡率比较，ATZ 组凋亡率升高，YYFZD 组凋亡率升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与ATZ 组凋亡率比较，ATZ+YYFZD 组凋亡率升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。在Lewis 肺癌，与Control 2 组凋亡率比较，ATZ 组凋亡率升高，YYFZD 组凋亡率升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与ATZ 组凋亡率比较，ATZ+YYFZD 组凋亡率升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

表1 养阴扶正方对PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌细胞凋亡的影响（±s，%）Table 1 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on the apoptosis of PD-L1+Lewis/Lewis lung cancer cells

表1 养阴扶正方对PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌细胞凋亡的影响（±s，%）Table 1 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on the apoptosis of PD-L1+Lewis/Lewis lung cancer cells

注：①与Control 1组比较P ＜0.05；②与Control 2组比较，P ＜0.05；③与ATZ组比较，P ＜0.05

凋亡率PD-L1+Lewis肺癌（n=24）Control 1组88.35±1.64 YYFZD组96.08±1.85①ATZ组94.4±1.25①ATZ+YYFZD组95.32±1.45③Lewis肺癌（n=24）Control 2组87.16±1.85 ATZ+YYFZD组97.81±0.69③ATZ组95.46±1.18②YYFZD组96.67±0.90②

图1 养阴扶正方对PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌细胞凋亡的影响Figure 1 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on the apoptosis of PD-L1+Lewis lung cancer cell/Lewis lung cancer cell

3.2 养阴扶正方对PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌细胞周期的影响

如表2、图2 所示，Control 1 组G1 期细胞数（54.26±1.02）%、S 期细胞数（22.23±1.10）%、G2期细胞数（22.85 ± 0.76）%，Control 2 组G1 期细胞数（54.69 ± 1.10）%、S 期细胞数（21.26 ± 0.54）%、G2 期细胞数（23.66±0.60）%，两组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。在PD-L1+Lewis 肺癌中，与Control 1 组比较，ATZ 组G1 期细胞数增多、S期、G2 期细胞数减少，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与Control 1组比较，YYFZD组G1期细胞数增多、S 期细胞数减少，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与ATZ 比较，ATZ+YYFZD 组G1 期细胞数增多，S 期、G2 期细胞数减少，差异有统计学意义（P ＜0.05）。在Lewis 肺癌，与Control 2 组比较，ATZ 组G1 期细胞数增多、S 期、G2 期细胞数减少，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与Control 2 组比较，YYFZD 组G1 期细胞数增多、S 期细胞数减少，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与ATZ 比较，ATZ+YYFZD组G1期细胞数增多、S期、G2期细胞数减少，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

表2 养阴扶正方对PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌细胞周期的影响（±s，%）Table 2 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on cell cycle of PD-L1+Lewis/Lewis lung cancer cells

表2 养阴扶正方对PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌细胞周期的影响（±s，%）Table 2 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on cell cycle of PD-L1+Lewis/Lewis lung cancer cells

注：①与Control 1组比较，P ＜0.05；②与Control 2组比较，P ＜0.05；③与ATZ组比较，P ＜0.05。

Lewis肺癌（n=24）Control组ATZ组YYFZD组ATZ+YYFZD组PD-L1+Lewis肺癌（n=24）G1期54.26±1.02 66.02±0.78①59.65±0.78①76.57±0.63①G2期23.66±0.60 20.43±0.62②17.77±6.01 12.60±0.69③S期22.23±1.10 13.64±1.02①17.16±0.52①8.03±0.71①G2期22.85±0.76 18.69±0.93①22.79±0.40 13.73±0.04③G1期54.69±1.10 65.36±0.59②61.61±1.31②77.69±1.23②S期21.26±0.54 12.85±0.85②15.92±0.57②7.23±0.40②

图2 养阴扶正方对PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌细胞周期的影响Figure 2 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on cell cycle of PD-L1+Lewis lung cancer cell/Lewis lung cancer cell

图3 PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌各组荷瘤鼠Bax、Bcl-2蛋白相对表达量的影响。Figure 3 Relative expression of Bcl-2 and Bax protein in lung carcinoma xenograft C57BL/6 mouse models of PD-L1+Lewis and Lewis lung cancer

3.3 养阴扶正方对PD-L1+ Lewis 肺癌/Lewis 肺癌Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

如图3、图4 所示，Control 1 组和Control 2 组的Bcl-2、Bax 蛋白的相对表达量为（0.93 ± 0.04，0.85 ± 0.07）、（0.24 ± 0.06，0.20 ± 0.06），两组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。

在PD-L1+Lewis 肺癌中，与Control 1 组比较，ATZ 组Bcl-2 蛋白相对表达量（0.37 ± 0.06）减少，Bax 蛋白相对表达量（0.94±0.12）增多，差异有统计学意义（P ＜0.05）。YYFZD 组Bcl-2 蛋白相对表达量（0.57±0.11）减少，Bax 蛋白相对表达量（0.61± 0.03）增多，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与ATZ 组比较，ATZ+YYFZD 组Bcl-2 蛋白相对表达量（0.22 ± 0.06）减少，差异有统计学意义（P ＜0.05）。在Lewis 肺癌中，与Control 2比较，ATZ 组Bcl-2蛋白表相对达量（0.38±0.08）减少，Bax蛋白相对表达量（0.97±0.13）增多，差异有统计学意义（P ＜0.05）。YYFZD 组Bcl-2 蛋白相对表达量（0.6±0.11）减少，Bax 蛋白相对表达量（0.99±0.12）增多，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与ATZ 组比较，Bcl-2 蛋白相对表达量（0.16 ± 0.04）减少，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

图4 West-blot检测PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌各组荷瘤鼠Bax、Bcl-2蛋白的水平Figure 4 Westblot analysis of Bcl-2 and Bax protein in lung carcinoma xenograft C57BL/6 mouse models of PD-L1+Lewis and Lewis lung cancer

3.4 养阴扶正方对PD-L1+ Lewis 肺癌/Lewis 肺癌Bax、Bcl-2基因表达的影响

如 图5 所 示，Control 1 组 与Control 2 组 的Bax、Bcl-2 的mRNA 的相对表达量分别为（1.00 ±0.07，1.01±0.18）、（1.0±0.08，1.00±0.07），两组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。在PD-L1+Lewis 肺癌中，与Control 1 组比较，ATZ 组Bcl-2mRNA 相对表达量（0.43 ± 0.03）减少，BaxmRNA相对表达量（4.2±0.43）增多，差异有统计学意义（P ＜0.05）；YYFZD 组Bcl-2mRNA 相对表达量（0.72 ± 0.05）减少，BaxmRNA 相对表达量（2.62 ±0.22）增多，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与ATZ组比较，ATZ+YYFZD 组BaxmRNA 相对表达量（8.35 ± 0.40）增多，差异有统计学意义（P ＜0.05）。在Lewis 肺癌中，与Control 2比较，ATZ 组Bcl- 2mRNA 表 相 对 达 量（0.29 ± 0.02）减 少，BaxmRNA相对表达量（4.23±0.49）增多，差异有统计学意义（P ＜0.05），YYFZD 组Bcl-2 mRNA 相对表达量（0.65 ± 0.07）减少，BaxmRNA 相对表达量（2.62±0.07）增多，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与ATZ 组比较，BaxmRNA 相对表达量（6.25±0.4）增多，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

图5 PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌各组荷瘤鼠Bax、Bcl-2mRNA相对表达量的影响Figure 5 Relative expression of Bcl-2 and Bax mRNA in lung carcinoma xenograft C57BL/6 mouse models of PD-L1+Lewis and Lewis lung cancer

4 讨论

肺癌是世界上发病率和死亡率居均首位的恶性肿瘤，是导致癌症相关死亡的最主要原因[6]。在恶性肿瘤中，我国的肺癌男性发病率居第一位，女性发病率居第二位，死亡率男、女均第一位[7]。肺癌的整体疗效差，其原因之一仍在于肺癌细胞逃避了宿主的免疫监视和杀伤，导致了免疫逃逸的发生。PD-1及PD-L1 可表达于多种肿瘤表面的共抑制分子，其与肿瘤的发生、发展密切相关。研究表明，其在介导多种实体肿瘤细胞免疫逃逸中发挥重要作用。PD-1单抗以及PD-L1单抗在肺癌的治疗中取得了较好的临床疗效，因此，本研究应用免疫磁珠法分选出PD-L1+Lewis细胞，研究其与Lewis细胞的生物学行为的差异。本研究结果显示PD-L1+Lewis 细胞和Lewis 细胞在凋亡率、细胞周期、凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表达方面无差异，表明PD-L1+Lewis 细胞和Lewis 细胞的生物学行为相同，也就是说肺癌细胞表达PD-L1 并没有增加肺癌细胞的恶性行为。

中医理论认为肿瘤的本质是细胞水平上阴阳平衡失调，肿瘤细胞增殖失控（阳盛），凋亡不足（阴衰），细胞凋亡过少而增殖过多，阳盛阴衰形成肿瘤；当凋亡速度大于增殖速度，即阴阳趋向于动态平衡态，则恶性肿瘤消退[8]。本研究表明养阴扶正方促进PD-L1+Lewis 细胞和Lewis 细胞的凋亡，细胞周期阻滞于G1期，降低Bcl-2、增加Bax蛋白及mRNA 的表达。养阴扶正方通过益气养阴，解毒散结，纠正了荷瘤的“阴衰”，促进了肺癌细胞的凋亡，即细胞增殖与凋亡趋向于“阴平阳秘”的动态平衡态，则恶性肿瘤自然消退。同时养阴扶正方可能作用G1、S 期的限制点，G1 期细胞数增多，S期细胞数减少，使细胞周期阻滞于G1 期，进入细胞周期的细胞数减少，发生凋亡的细胞数增多，抑制了肿瘤细胞的增殖。

阿特珠单抗是一种针对PD-L1 的选择性人源化单克隆IgG1 抗体，作用于PD-L1，阻止其与PD-1的相互作用，阻断T淋巴细胞负性调控的来源，逆转肿瘤免疫耐受性并重新建立针对肿瘤细胞的适应性免疫应答，以此来达到免疫治疗的目的。该药用于Ⅲ、Ⅳ期NSCLC、无中枢神经系统转移的NSCLC、经含铂双药治疗后进展的晚期非小细胞肺癌、Ⅳ期及新发转移的非鳞NSCLC 的治疗[9]。本研究表明阿特珠单抗可促进PD-L1+Lewis、Lewis 细胞的凋亡，将细胞周期阻滞于G1期，降低Bcl-2 的蛋白及mRNA 的表达，促进Bax的蛋白及mRNA 的表达，与养阴扶正方联合应用，上述作用得到了加强，推测其机制可能是阿特珠单抗阻止肺癌细胞上的PD-L1与T细胞上PD-1 的相互作用，逆转了肺癌细胞的免疫耐受，T 细胞的免疫功能得到了有效的发挥，同时养阴扶正方增强了阿特珠的功效，其机制将在后续的实验中证实。

综上所述，PD-L1+Lewis 肺癌、Lewis 肺癌细胞的生物学行为相同，养阴扶正方通过调节Bax、Bcl-2 蛋白及mRNA 表达，促进PD-L1+Lewis 肺癌细胞、Lewis肺癌细胞凋亡，使细胞周期阻滞于G1期，增加了阿特珠单抗的疗效，养阴扶正方与PD-L1抗体的联合应用，为肺癌的治疗提供了新的思路。