飞燕草素对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞糖酵解的影响

李 桃,邓媛绿,徐嘉琦,文 湘,杨元香,李佳欣,韩 彬,彭晓莉

(成都医学院公共卫生学院,四川成都 610500)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁女性的身心健康[1]。研究发现,黄酮类化合物是植物性食物中主要的功效成分,对乳腺癌具有积极的防治作用[2-4]。花青素是一种常见的黄酮类化合物,共有6种单体,飞燕草素是花青素中常见的一种单体,属黄酮类化合物,常存在于黑米、葡萄等深色食物中。研究发现飞燕草素具有抗肿瘤、抗心血管疾病等多种生物学活性[5-8]。花青素化学结构中B环上的邻二苯酚结构是其发挥抑癌效应的结构基础,飞燕草素B环羟基数量较其它花青素单体多,是花青素中具有显著生物学效应的单体[9]。飞燕草素能抑制肿瘤细胞生长和增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤血管生成和侵袭转移[10-12]。

研究发现富含花青素的草莓提取物能抑制肿瘤细胞糖酵解[13]。含飞燕草素的马奇果提取物具有调节糖代谢的作用[14]。糖酵解是肿瘤细胞能量代谢重要特征,肿瘤细胞在供氧充足条件下也会选择糖酵解途径作为主要产能方式[15]。葡萄糖通过细胞膜葡萄糖转运体转入细胞内,经糖酵解途径生成丙酮酸,后者在乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)作用下转化成乳酸和ATP[16]。肿瘤细胞中大约有50%的ATP是通过糖酵解途径合成。葡萄糖经糖酵解途径生成乳酸的过程中,己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)、乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase-A,LDHA)和M2-型丙酮酸激酶2(Pyruvatekinase type M2 pyruvatekinase,PKM2)等关键代谢酶在肿瘤细胞有氧糖酵解中发挥重要作用[20]。蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin,TOR)通路整合了生长因子、营养信号和能量代谢信号通路,与肿瘤细胞有氧糖酵解关系密切[17]。

三阴性乳腺癌占所有乳腺癌的10%～20%,由于缺少雌激素受体、孕酮受体及表皮生长因子受体,靶向治疗此类乳腺癌的难度较高[18-19]。与其他类型的乳腺癌相比,三阴性乳腺癌在治疗第一年后表现出更强的侵袭能力和高复发率[20-21]。本研究利用飞燕草素作用于三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞,检测飞燕草素对乳腺癌细胞摄取葡萄糖、乳酸生成、ATP水平和HK活性的影响,蛋白质印迹法检测飞燕草素对乳腺癌细胞糖代谢相关酶蛋白、p-Akt和p-mTOR蛋白表达的影响,从糖代谢角度初步探讨飞燕草素通过抑制糖代谢进而发挥抑制乳腺癌细胞的机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人乳腺癌MDA-MB-231细胞 中国科学院上海细胞库;飞燕草素(纯度,≥95%) 美国Sigma公司;细胞培养基 美国Gibco公司;胎牛血清 德国Millipore公司;BCA蛋白定量试剂盒 美国Termo公司;抗体 美国Cell Signaling Technology公司;ATP、葡萄糖和乳酸测定试剂盒 南京建成生物技术有限公司。

IX71型倒置荧光相差显微镜 日本Olympus公司;Biofuge stratos台式高速冷冻离心机、ND-2000微量紫外可见光分光光度计 美国Thermo公司;ChemiDoc XRS化学发光成像仪 美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 MDA-MB-231细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,置于37 ℃、5% CO2培养箱培养,选对数生长期细胞实验。

1.2.2 CCK-8检测细胞活性 对数期细胞用胰酶消化后制成细胞悬液。将细胞稀释至8×104cell/mL,接种于96孔板,24 h后,加入0、5、10、20、40、80 μmol/L飞燕草素共6个浓度,每个浓度3个复孔。DMSO作为溶剂对照。不同浓度的飞燕草素作用48 h后,吸弃原培养基,加入含10% CCK-8的新培养基100 μL/孔,37 ℃ 孵育2 h,酶标仪450 nm波长检测吸光度,记录OD值。计算细胞存活率。

细胞存活率(%)=(OD试验孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)×100

1.2.3 细胞Ki67免疫组化染色 细胞固定后,进行免疫组化染色,辣根过氧化物酶显色试剂盒进行显色处理,用PBS缓冲液作为阴性对照,免疫组化染色后以细胞核呈中等强度棕黄色判定为阳性细胞,对阳性细胞进行计数,以阳性细胞在一个视野中同类型细胞中的百分比表示阳性率,每组选五个视野计算平均值。

1.2.4 细胞划痕试验 对数期的MDA-MB-231细胞以1×105cell/mL密度接种于12孔培养板。细胞生长至75%密度,分别以0、20、40 μmol/L飞燕草素作用细胞,24 h后用20 μL枪头沿线垂直划痕,PBS冲洗除去悬浮细胞,加入无血清培养基,在实验0、24 h拍照,每个实验组随机取5个视野。计算迁移率。

迁移率(%)=(划痕后测得的划痕面-划痕后某时间点测得的无细胞区域面积)/划痕后测得的划痕面积×100

1.2.5 细胞葡萄糖摄取量检测 葡萄糖氧化酶法测定细胞培养上清中葡萄糖含量。每个样设3个复孔,同时设空白管和标准管,波长505 nm处比色,空白管调零,读取标准管及测定管吸光度。

1.2.6 乳酸生成量检测 乳酸酶法检测细胞乳酸浓度。乳腺癌细胞消化后以 3×104cell/孔的细胞数接种于24孔板,飞燕草素作用细胞12、24 h后,按说明书步骤测定。吸取培养液,离心后取0.02 mL上清,加入酶工作液,显色剂,37 ℃水浴后,加入终止液终止反应,530 nm波长处测定光密度值。每组设3个复孔、空白管和标准管。

乳酸浓度(mmol/L)=(测定OD值-空白OD值/标准OD值-空白OD值)×标准品浓度×样本测试前稀释倍数

1.2.7 细胞ATP浓度测定 乳腺癌细胞消化后以3×104cell/孔的细胞数接种于24孔板,飞燕草素作用细胞12、24 h后,胰酶消化,测定待测样本的蛋白浓度。细胞ATP 浓度按说明书步骤测定在636 nm波长处测定各孔的光密度值。

ATP浓度(μmol/g)=(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度×样本稀释倍数/待测样本蛋白浓度。

1.2.8 HK活性的检测 乳腺癌细胞消化后以3×104cell/孔的细胞数接种于24孔板,飞燕草素作用细胞12、24 h后,胰酶消化,测定待测样本的蛋白浓度。按HK活性试剂盒说明书加入试剂,加入样本的同时开始计时,充分混匀,移至比色皿中,记录30 s时340 nm波长处的吸光度(A1),然后将比色皿中的反应液倒入预先编号的原试管中,放入37 ℃浴箱中准确水浴15 min,取出试管测定15.5 min时的吸光度(A2)。HK活性的计算公式为:

HK(U/gprot)=1286×ΔA/Cpr

式中:ΔA表示A2-A1;Cpr表示样本蛋白质浓度,mg/mL。

1.2.9 Western blot(WB)检测蛋白表达 飞燕草素作用细胞24 h后,收集细胞,提取胞浆总蛋白,测定蛋白质浓度;调节样品浓度,保证每个样品上样量为35 g;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离,转膜,抗体孵育过夜;二抗孵育后,化学试剂显色发光,采用多功能成像系统进行曝光。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 飞燕草素对MDA-MB-231细胞存活率和Ki67表达的影响

图2可知,20、40、80 μmol/L飞燕草素作用MDA-MB-231细胞,能显著降低细胞存活率。20和40 μmol/L飞燕草素能分别降低细胞存活率至75%和72%(P<0.05)。实验结果表明,飞燕草素能有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖。

图2 飞燕草素对MDA-MB-231细胞存活率的影响

Ki67是检测肿瘤细胞增殖的重要指标。结合细胞存活率实验结果,去除5和80 μmol/L的剂量,采用0、10、20、40 μmol/L飞燕草素处理乳腺癌MDA-MB-231细胞,免疫组化检测乳腺癌细胞Ki67的表达。如图3所示,乳腺癌细胞出现棕黄色或黄褐色沉淀物,为Ki67阳性细胞。乳腺癌细胞Ki67蛋白表达阳性率为94%,20 μmol/L飞燕草素处理组Ki67阳性率为55%,40 μmol/L飞燕草素处理组Ki67阳性率为52%。20、40 μmol/L飞燕草素能明显降低乳腺癌MDA-MB-231细胞Ki67表达阳性的细胞数量,差异有统计学意义(P<0.01)。

图3 飞燕草素对MDA-MB-231细胞Ki67表达的影响(10×)

2.2 飞燕草素对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响

细胞划痕试验检测乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移能力,迁移率越高,说明细胞迁移能力越强。预实验采用0、10、20 μmol/L飞燕草素分别作用MDA-MB-231细胞,结果发现与0、10 μmol/L飞燕草素相比,20 μmol/L飞燕草素对细胞迁移率有抑制作用。因此,实验采用0、20、40 μmol/L飞燕草素,检测飞燕草素对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响。0、20、40 μmol/L飞燕草素作用乳腺癌MDA-MB-231细胞,24 h时迁移情况如图4所示。24 h时0、20、40 μmol/L飞燕草素作用的乳腺癌细胞迁移率分别为85%、64%和21%。与0、20 μmol/L飞燕草素组相比,40 μmol/L飞燕草素24 h时能明显抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移能力(P<0.01)。实验结果表明飞燕草素能显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移能力。

图4 飞燕草素对MDA-MB-231细胞迁移的影响

2.3 飞燕草素对乳腺癌MDA-MB-231细胞葡萄糖摄取的影响

根据CCK-8实验结果,采用0、10、20、40 μmol/L飞燕草素作用MDA-MB-231细胞12 h和24 h,检测培养液中的葡萄糖浓度,计算细胞对葡萄糖的摄取量。由图5可见,飞燕草素作用MDA-MB-231细胞12 h,细胞培养液中葡萄糖浓度没有显著差异;飞燕草素作用MDA-MB-231细胞24 h后,与0 μmol/L飞燕草素相比,20、40 μmol/L飞燕草素能显著降低细胞对葡萄糖的摄取,差异有统计学意义(P<0.05)。实验结果表明,飞燕草素能降低乳腺癌MDA-MB-231细胞对葡萄糖的摄取。

图5 飞燕草素对乳腺癌细胞MDA-MB-231葡萄糖摄取的影响

2.4 飞燕草素对乳乳腺癌MDA-MB-231细胞乳酸生成的影响

飞燕草素作用MDA-MB-231细胞12和24 h后,检测培养液中的乳酸生成水平。由图6可见,不同浓度的飞燕草素作用MDA-MB-231细胞12 h,细胞培养液中乳酸水平没有显著差异;飞燕草素作用MDA-MB-231细胞24 h,与0 μmol/L 对照组相比,40 μmol/L飞燕草素能极显著降低细胞乳酸生成水平,差异有统计学意义(P<0.01)。实验结果表明,飞燕草素能降低乳腺癌细胞MDA-MB-231乳酸的生成。

图6 飞燕草素对乳腺癌MDA-MB-231细胞乳酸生成的影响

2.5 飞燕草素对乳腺癌MDA-MB-231细胞ATP浓度的影响

飞燕草素作用MDA-MB-231细胞12和24 h后,检测细胞ATP的水平。由图7可见,飞燕草素作用MDA-MB-231细胞12 h,与0 μmol/L对照组相比,40 μmol/L飞燕草素能显著降低细胞ATP水平,差异有统计学意义(P<0.05)。飞燕草素作用MDA-MB-231细胞24 h,20和40 μmol/L飞燕草素能显著降低细胞ATP生成,且具有统计学意义(P<0.05)。实验结果表明,飞燕草素能降低乳腺癌MDA-MB-231细胞ATP生成的水平。

图7 飞燕草素对乳腺癌MDA-MB-231细胞ATP浓度的影响

2.6 飞燕草素对乳腺癌MDA-MB-231细胞HK活性的影响

飞燕草素作用MDA-MB-231细胞12和24 h后,检测HK活性。由图8可见,不同浓度的飞燕草素作用MDA-MB-231细胞12 h,细胞HK活性没有显著差异;飞燕草素作用MDA-MB-231细胞24 h,20和40 μmol/L飞燕草素能极显著降低细胞己糖激酶活性,差异有统计学意义(P<0.01)。实验结果表明,飞燕草素能降低乳腺癌MDA-MB-231细胞HK活性。

图8 飞燕草素对乳腺癌细胞MDA-MB-231 HK活性的影响

2.7 飞燕草素对乳腺癌MDA-MB-231细胞糖代谢相关酶蛋白表达的影响

飞燕草素作用乳腺癌MDA-MB-231细胞24 h后检测飞燕草素对PKM2、LDHA 和HK蛋白表达的影响。由WB实验结果(图9)可见,40 μmol/L飞燕草素作用乳腺癌MDA-MB-231细胞,能显著降低细胞PKM2、LDHA和HK蛋白表达蛋白表达水平。

图9 飞燕草素对乳腺癌MDA-MB-231细胞糖代谢相关酶蛋白表达的影响

2.8 飞燕草素对乳腺癌MDA-MB-231细胞Akt/mTOR通路的影响

飞燕草素作用乳腺癌MDA-MB-231细胞24 h后检测飞燕草素对Akt/mTOR通路的p-Akt和p-mTOR蛋白表达的影响。由WB实验结果(图10)可见,40 μmol/L飞燕草素作用乳腺癌MDA-MB-231细胞,能显著降低细胞p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平。

图1 飞燕草素的化学结构

图10 飞燕草素对乳腺癌细胞MDA-MB-231 Akt/mTOR通路的影响

3 结论与讨论

乳腺癌细胞通过强化糖酵解功能,大量快速的生成ATP,以适应肿瘤细胞生长和增殖的需要,抑制糖酵解能够抑制乳腺癌的生长和增殖[22]。本实验研究发现飞燕草素能抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的活性,降低乳腺癌细胞迁移能力,进一步的研究结果发现飞燕草素能抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞对葡萄糖的摄取,并降低乳酸生成,降低细胞ATP水平。结果提示飞燕草素能影响乳腺癌MDA-MB-231细胞对葡萄糖的利用。

PKM2、LDH和HK的水平是评价糖酵解活性的重要标准[23]。本研究发现飞燕草素可明显抑制PKM2、LDHA和HK蛋白表达,表明飞燕草素具有抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231糖酵解的效应。本研究同时发现飞燕草素能降低p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平,证实飞燕草素具有抑制Akt/mTOR通路的作用。Akt/mTOR的活化在细胞能量代谢中发挥重要作用,mTOR能控制和促进有氧糖酵解关键酶PKM2的转录和表达[24-25]。飞燕草素是否能通过Akt/mTOR通路调节乳腺癌细胞MDA-MB-231糖酵解,需要进一步的实验证实。

综上所述,本研究发现飞燕草素能抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞对葡萄糖利用,抑制糖酵解相关酶蛋白的表达,飞燕草素可能通过Akt/mTOR通路制糖酵解,其机制值得进一步研究。