应用超声生物显微镜观察肥胖小鼠心脏早期炎症损伤的改变

王琴，马鑫，徐静，潘璐，张娇，刘罗娜

1.宁夏医科大学总医院心脏中心功能检查部，宁夏银川 750004；2.宁夏医科大学，宁夏银川 750004； *通讯作者 王琴13995290877@163.com

近年来，越来越多的临床和解剖学资料发现，肥胖导致的心脏病患者在出现冠状动脉粥样硬化前已出现心脏结构和功能的改变[1]，但早期肥胖患者的心脏结构与功能改变进程尚未明确。目前认为肥胖是一种慢性代谢性炎症，是发生在脂肪组织的炎症状态。多种内源性或外源性危险信号通过激活NLRP3 炎症小体上调炎性因子的表达水平、介导细胞凋亡，从而促进慢性炎症的发生、发展[2]。因此，深入研究NLRP3炎症小体激活机制对肥胖早期心肌损伤防治具有重要意义。本研究应用超声生物显微镜（ultrasound biomicroscopy，UBM）追踪观察肥胖小鼠及正常小鼠心肌应变及二维超声的测值，并通过检测NLRP3 炎症小体蛋白水平表达，分析UBM 在监测肥胖小鼠早期心肌损伤改变的作用及肥胖小鼠心肌损伤改变与NLRP3 炎症因子的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取120 只6 周龄雄性C57BL/6 小鼠（合格证号为20180006001186），体重20～30 g，喂以高脂饲料。选取体重及Lee’s 指数分别大于对照组平均±1.5 倍标准差的肥胖小鼠模型60 只，分为肥胖模型组、肥胖+慢病毒空载体组、肥胖+NLRP3-miRNA 慢病毒组，每组20 只。肥胖+NLRP3-miRNA慢病毒组小鼠经颈静脉注射NLRP3-miRNA 慢病毒，剂量0.2×108TU/只，干预时间8 周。另纳入20 只C57BL/6 小鼠与实验组同龄、同性别小鼠作为对照组。涉及动物所执行的程序均获得宁夏医科大学总医院伦理委员会批准。

1.2 UBM 检查方法

1.2.1 仪器及实验动物准备 采用Vevo 2100 高分辨超声成像系统（Visualsonics 公司），配置30 MHz 探头，分辨率40 μm，选用RMV-707B 单晶片机械扇扫探头，探头频率30 MHz。使用2%异氟烷麻醉小鼠，以仰卧位固定于恒温平台上，固定四肢并连接在心电图电极。成像前使用化学脱毛剂脱去胸部毛发。麻醉开始后，采集小鼠心率平稳时的超声心动图数据。

1.2.2 UBM 检查方法 经胸骨左缘、心尖等扫查窗口。分别采用二维、M 型和多普勒采集左心室长轴及各水平短轴、心尖四腔心切面，进而测量其内径，并获得各瓣口的血流频谱。分析左心收缩及舒张功能。动态观察小鼠左心室超声生物学特性，包括形态学、血流动力学、功能、应变的变化。形态学改变包括采集左心室长轴切面，测得室间隔左心室后壁厚度及左心室舒张及收缩内径。应用M 型超声测定室间隔及左心室后壁，左心室收缩末期内径（Ds）及舒张末期内径（Dd）。用Teichholtz 校正公式计算左心室射血分数（LVEF）；血流动力学分析测定二尖瓣口舒张早期血流速度（E）、舒张晚期血流速度（A）及两者的比值；应用应变及应变率显像技术（VevoStrain，VisualSonics）测定左心室心肌应变及应变率参数。径向和圆周应变及应变率由乳头肌左心室短轴切面测得。软件自动追踪心内膜得出心肌整体应变及应变率曲线，获得各切面心肌应变及应变率参数。

1.2.3 心肌组织NLRP3 蛋白表达 采用免疫印迹法测定心肌组织NLRP3 炎症蛋白表达。以裂解液裂解心肌组织，提取心肌组织蛋白。采用Bradford 法测定心肌组织的总蛋白含量。等量上样，在12%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。以电转膜方法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，考马斯亮蓝染色，观察转移效果后洗脱。用含5%脱脂奶粉的TBS 缓冲液封闭过夜。兔抗大鼠NLRP3 单克隆抗体进行免疫反应，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，DAB 显色。结果在图像系统中进行分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS 21.0 软件，计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二维超声心动图参数比较 UBM 测量对照组、肥胖组、肥胖+慢病毒空载体组、肥胖+NLRP3-siRNA 组小鼠二维超声指标左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）、LVEF、心率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 各组小鼠常规超声指标比较（ ±s）

表1 各组小鼠常规超声指标比较（ ±s）

注：LVEDD 为左心室舒张末期内径，LVESD 为左心室收缩末期内径，IVSd 为室间隔厚度，LVPWd 为左心室后壁厚度，LVEF为左心室射血分数

测量指标肥胖组肥胖+慢病毒空载体组肥胖+NLRP3-siRNA 组对照组F 值P 值LVEDD（mm） 3.36±0.20 3.60±0.06 3.48±0.10 3.41±0.10 0.965 >0.05 LVESD（mm）2.44±1.15 2.55±0.05 2.44±0.10 2.40±0.10 1.721>0.05 IVSd（mm） 0.79±0.05 0.78±0.04 0.71±0.02 0.64±0.02 5.532 <0.05 LVPWd（mm）0.63±0.11 0.70±0.22 0.76±0.15 0.71±0.16 2.112>0.05 LVEF（%） 48.76±3.79 53.90±2.04 56.00±2.41 58.80±1.97 1.943 >0.05心率（次/min）441.90±9.40 458.00±15.44 425.40±23.20 445.70±10.81 0.575>0.05 E/A 1.71±0.28 1.70±0.60 2.02±0.68 1.67±0.34 2.137 >0.05

2.2 应变参数比较 UBM 显示对照组、肥胖组、肥胖+慢病毒空载体组、肥胖+NLRP3-siRNA 组小鼠纵向应变及圆周应变组间差异有统计学意义（P<0.05）。肥胖组、肥胖+慢病毒空载体组小鼠纵向应变参数明显低于对照组及肥胖+NLRP3-siRNA 组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 各组小鼠心外膜应变参数比较（ ±s）

表2 各组小鼠心外膜应变参数比较（ ±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与肥胖+NLRP3-siRNA 组比较，#P<0.05

参数对照组肥胖组肥胖+慢病毒空载组肥胖+NLRP3-siRNA 组F 值P 值纵向应变 22.04±2.89 7.35±1.37*# 11.06±1.22*# 17.11±3.10 7.168 <0.05径向应变23.49±3.08 16.00±2.11 16.56±1.91 20.90±2.14 2.264>0.05圆周应变 20.10±2.00 29.84±2.67 23.71±1.68 23.27±2.48 3.018 <0.05

2.3 NLRP3 蛋白水平比较 Western blot 显示对照组及肥胖+NLRP3-siRNA 组小鼠的NLRP3 蛋白表达条带明显减低（图1）。

3 讨论

C57BL/6 小鼠是目前食物诱导肥胖代谢性疾病研究中常用的动物模型。肥胖C57BL/6 小鼠随周龄增长可自然发生肥胖相关代谢异常所致心肌损伤，如无干预可发展至心力衰竭，与肥胖人群的心肌发展规律非常相似[3]。然而小鼠心率快、体积小，临床所用的高频超声分辨力不理想。因此，准确评估小鼠的心功能影像检查比较困难。UBM 是一种无创、实时、活体、动态研究小动物微小结构形态及功能评价的方法，分辨率达30 µm，图像与组织切片具有高度相关性，可清晰显示小鼠的心脏及大血管等微小结构和多普勒血流信息，并进行精确定量检测以及连续动态观察[4]。因此，本实验选择UBM 观察和测量肥胖小鼠的左心室结构及功能具有良好的可行性。应变及应变率显像是UBM 中检测心肌功能的新技术[5]。心肌应变指心肌在心动周期中发生的变形，可用于评价局部心肌的收缩功能与舒张功能、血供情况及心肌活力等[6]。应变及应变率显像可定性及定量地显示心肌收缩功能，为研究心脏整体和部分力学运动提供了崭新的定量方法。该方法无角度依赖，且帧频较高。因此，本实验应用UBM 定量分析肥胖小鼠模型心肌收缩力学特征。

肥胖诱导的心肌重构是指心肌结构、功能和表型的改变，包括心室质量、体积或形态改变，纤维化含量增加，细胞肥大和细胞死亡等[7]。当机体肥胖时，脂质过度沉积于白色脂肪组织中，使其功能受损，减少了脂肪因子的分泌；同时心外膜和其他内脏的脂肪组织释放TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎性因子至循环系统，从而可能导致全身炎症。系统性炎症促进心外膜脂肪组织的积累以及进一步的局部和全身炎症诱导终末器官功能障碍[8]。本研究结果显示，肥胖组、肥胖+慢病毒空载体组较对照组、肥胖+NLRP3-siRNA 组小鼠室间隔厚度增大，在肥胖小鼠早期室间隔代偿性增厚，心脏代偿作用下心肌环向收缩功能增强。因此，肥胖组、肥胖+慢病毒空载体组较对照组、肥胖+NLRP3-siRNA 组小鼠圆周应变增加；而肥胖组、肥胖+慢病毒空载体组较对照组、肥胖+NLRP3-siRNA 组小鼠纵向应变减低，提示肥胖小鼠心脏形态学发生早期改变，心肌收缩力减低，提示肥胖早期心肌出现损伤，心脏结构已发生重构。NLRP3 炎症小体是胞内模式识别受体NLR 家族成员之一，参与炎症反应[9-10]。NLRP3 炎症小体的激活是脂质蓄积诱导肥胖发展的重要环节，堆积的脂肪组织释放炎症介质进入循环系统可以引起心肌重构。本研究前期应用应变技术观察到肥胖小鼠存在心肌早期收缩功能降低。Aloysius 等[11]在心肌梗死模型小鼠发现使用siRNA 或药物抑制NLRP3 和P2X7 受体将使炎症小体活化受到抑制。结果发现心肌细胞死亡减少，最终减轻心肌重构。因此，本研究采用Western Blot 检测炎症标志物NLRP3 的蛋白表达水平，结果显示NLRP3 蛋白在肥胖+NLRP3-siRNA 组及对照组的表达水平显著减低，与上述研究结果一致，表明应用NLRP3-siRNA 可以明显改善肥胖小鼠的心肌炎症，提示NLRP3 炎症小体可能成为干预肥胖心肌早期损害发生及发展的重要靶标，有必要进一步探讨其调控肥胖心肌损伤的分子机制。

图1 NLRP3 各组蛋白水平比较。1 为对照组，2 为肥胖模型组，3 为肥胖+慢病毒空载体组，4 为肥胖+NLRP3-siRNA 慢病毒组

总之，UBM 可监测肥胖小鼠的心肌收缩功能改变情况，应变值可作为评估肥胖心肌收缩功能改变的一个准确和有效的指标，血清NLRP3 炎症因子与肥胖心肌早期损伤有关。