GHRHR 基因在湘西黄牛不同组织中表达差异性研究

资琼涛 黄胥莱 陈东* 万发春 沈维军 易康乐 唐江权 李付强

（1，湖南农业大学动物科学技术学院 410128；2，湖南畜牧兽医研究所 410130；3，湖南天华实业有限公司 417000）

随着人们收入水平的不断提高，人们的消费从追求数量转而追求质量，牛肉以其高营养价值也渐渐受到消费者的青睐。肉牛体内的肌内脂肪沉积，不仅影响牛肉的断面大理石评分，还可显著提高牛肉的嫩度、多汁性和风味等感官品质，从而最终影响其肉质等级与经济价值[1]。脂肪沉积量主要取决于脂肪细胞的增殖和分化程度，这一过程受许多分化转录因子的协同调控作用，转录因子的表达量及其活性的大小决定了分化过程[2]。因此，研究湘西黄牛脂肪沉积调控的分子机制对品种选育具有重要意义。

GHRHR 属于G 蛋白偶联受体家族的成员之一，对动物机体的生长发育起关键作用，主要由GHRHR 基因调控分泌[3]。GHRHR 主要通过与GHRH 结合，以cAMP 为第二信使的信号通路激活垂体细胞合成并分泌GH，从而调控动物机体的生长发育[4]。张存芳等[5]等用PCR-SSCP 和DNA 测序鉴定GHRHR-5'UTR 中的一个新的单核苷酸多态性（NM_181020：c.102C＞T），发现该位点与纽约牛6 个月的体重（BW）显著相关。刘艳丽[6]等对西农萨能奶山羊和关中奶山羊的GHRHR基因进行研究时发现，P3 位点上的多态性与西农萨能奶山羊的身高和体长相关性显著，与关中奶山羊的胸围、身高和体长显著相关。这些研究都表明，GHRHR 基因对动物机体体重、身高等都有重要的影响。基于目前的研究现状，本研究旨在研究GHRHR 基因在湘西黄牛不同组织中的发育性表达，为改善牛肉品质及选育优良品种提供可借鉴的遗传学资料。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲养管理

分别选取湖南德农牧业集团有限公司国家级湘西黄牛保种场6、18 月龄和30 月龄湘西黄牛各10 头。试验牛在4 月龄时断奶，每日精补料按照体重0.5%饲喂，精补料由55%玉米、豆粕24%、小麦麸15%、预混料4%、食盐0.5%、小苏打0.5%和碳酸氢钙1%，其中每千克预混料含VA162.5K IU，VD25K IU，VE500 IU，碘12.5mg，钴2.5mg，铜250mg，铁125mg，锌750mg，锰1g，硒7.5mg。于每天的07:00 和14:30 进行饲喂，先粗后精，粗料由稻草组成，粗料自由采食，自由饮水。所有试验牛均健康无病，免疫程序一致，并进行统一管理。

1.2 屠宰及样品采集

在6、18 和30 月龄试验牛中随机挑选4 头体况和体重相近的牛，空腹后于晨饲前进行屠宰取样，分别采集肝脏、12～13 肋骨背最长肌、皮下脂肪和腹腔脂肪4 个组织的样品，迅速放入液氮中保存，之后置于实验室-80℃冰箱保存备用。

1.3 主要试剂

TRIzol 试剂盒（Thermo Fisher Scientific 公司）、逆转录试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）、荧光定量试剂盒（百泰克）；氯仿和无水乙醇均购自康为世纪生物有限公司。

1.4 引物设计及合成

表1 实时定量PCR 引物序列

根据GenBank 中牛GHRHR 基因序列，采用Primer Premier 5.00 软件设计特异引物，以牛GAPDH 和β-actin 基因作为内参，由上海生工生物股份有限公司设计合成实时定量PCR 引物，引物序列见表1。

1.5 总RNA 提取及cDNA 第一条链合成

取约50mg 的组织样，置于液氮中研磨之后，用Trizol 法(Thermo Fisher Scientific 公司) 提取总RNA。用超微量紫外分光光度计检测其浓度和OD 值（OD260nm/OD280nm=1.8～2.0）。用超微量分光光度计定量，OD260nm/OD280nm值均在1.82～2.04 之间，说明提取的总RNA 纯度较高，可以用于后续的反转录及实时荧光定量PCR。根据逆转录试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）说明书将总RNA（1ug）反转成cDNA。20uL 体系，反应条件为：65℃ 5min，42℃60min，25℃5min，70℃5min，逆转录后的cDNA 置于-80℃冰箱保存。

1.6 实时荧光定量PCR

采用SYBR Green 荧光染料法在实时荧光定量PCR 仪上进行定量。反应体系（20ul）：2×Fast SYBR.Green Master Mix 10μL，cDNA 1μL，无菌水8μL，下游引物0.5μL 和上游引物0.5μL。反应条件：95℃15s，95℃5s，60℃30s，95℃60s，60℃60s，40 个循环后进行溶解曲线分析，以每5s 上升0.5℃的速率从65℃升高到95℃，荧光信号在循环结束时检测，每个样品做3 个重复。PCR 反应产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.7 统计分析

实时荧光定量PCR 得出的基因原始表达量用2-△△Ct法计算，2-△△Ct表示试验目的基因mRNA 的相对表达量。利用SAS 9.0 软件one-way ANOVA 程序进行统计分析，表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 GHRHR 基因在不同月龄湘西黄牛的相同组织中发育性表达的差异

由表2 可知，湘西黄牛在18 月龄GHRHR 基因的表达量极显著高于6 月龄和30 月龄GHRHR 基因的表达量30 月龄GHRHR 基因的表达量极显著高于6 月龄

2.2 GHRHR 基因在相同月龄湘西黄牛不同组织中的表达差异

由表3 可知，GHRHR 基因在6 月龄的湘西黄牛各组织中的表达量差异不显著在18 月龄时，背最长肌与皮下脂肪中GHRHR 基因的表达量显著高于肝脏中的表达量30 月龄时，各组织中的表达量两两之间差异显著且皮下脂肪＞背最长肌＞腹腔脂肪＞肝脏。

表2 GHRHR 基因在不同月龄湘西黄牛中的表达差异

表3 GHRHR 基因在湘西黄牛不同组织中的发育性表达

3 讨论

Wang 等[7]研究发现，GHRHR 基因的表达主要局限于垂体或大脑。王英明等[8]以泸宁鸡和罗斯白羽肉鸡为研究对象，发现GHRHR 基因主要在垂体中表达，在其他组织上极少表达或基本不表达。本研究发现，GHRHR 基因在湘西黄牛脂肪代谢关键部位均有表达，随着月龄的增加，GHRHR 基因的表达量先增加后减少，在18 月龄的表达量达到最高，说明GHRHR基因的表达与湘西黄牛生长发育阶段有关，且GHRHR 基因在各组织的表达存在月龄间差异性。在6 月龄时，各组织间GHRHR 基因的表达量无显著差异；而18 月龄和30 月龄时肝脏中GHRHR 基因的表达量最低，皮下脂肪最高，且各组织间GHRHR 基因的表达量存在显著差异，这说明GHRHR 基因的表达量存在组织差异性。

研究表明，GHRHR 基因在生殖系统中受GH 基因的调控发挥生物学功能[9]。脂肪沉积与脂肪细胞的发生、脂肪合成和脂解作用有关，GH 可促进脂类分解，抑制脂肪的合成[10,11]。Straus 等[12]研究报道GH 可诱导前脂肪细胞系（3T3-L1、3T3-F442A 和Ob1771）中的前脂肪细胞分化为脂肪细胞，促进脂肪生成。而Wabitsch 等[13]在体外原代培养脂肪的前体细胞试验中发现，GH 显著降低新脂肪细胞的生成，且剂量依赖性的降低甘油3-磷酸脱氢酶的活性，抑制脂肪的生成。上述研究表明，GH 对脂肪生成的影响与其对脂肪的合成和分解作用存在一定差异性。Alba 等[14]研究发现，GHRHR 敲除小鼠的体重、肝脏重、肾脏重和心脏重均低于正常小鼠。张海波等[15]通过敲除小鼠皮下脂肪组织的CD29 和CD34 基因相对表达量的测定发现，GHRHR 基因可以增加干细胞的增殖，促进脂肪沉积。上述研究表明，GHRHR 基因在动物机体生长发育及脂肪代谢过程中发挥重要作用。本研究初步探讨了6 月龄、18 月龄和30 月龄湘西黄牛脂肪代谢关键部位GHRHR 基因的表达规律，对GHRHR 基因与牛脂肪沉积之间的关系有待进一步探究。

4 结论

GHRHR 基因在6 月龄、18 月龄及30 月龄湘西黄牛脂肪代谢关键部位均有表达，且差异显著，存在月龄和组织间的差异性。GHRHR 基因对湘西黄牛机体脂质代谢具有重要作用，为湘西黄牛品种选育及肉质改善奠定了基础。