HPLC法测定椿皮中铁屎米-6-酮生物碱的含量

李永春　赵美荣　张智

摘 要：目的：建立测定椿皮中铁屎米-6-酮含量的HPLC方法.方法：采用色谱柱Ultimate AQ-C18（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.1%乙酸（35：65），检测波长254nm，流速1.0mL·min-1，柱温30℃，进样量20μL.结果：铁屎米-6-酮进样浓度在1.10～15.35μg·mL-1（r=0.9994）的范围内与峰面积线性关系良好，平均回收率（n=6）为99.66%，RSD值为1.38%.结论：建立的方法简便可靠稳定，为椿皮质量的分析及评价提供参考.

关键词：HPLC;臭椿;铁屎米-6-酮;含量测定

中图分类号：R927.2;O657.72  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2020）03-0039-02

椿皮是苦木科臭椿属植物臭椿（Ailanthus altissima （Mill.） Swingle）的干燥根皮或茎皮，又称椿根皮，是我传统的中药材，具有清热燥湿、止血消炎等功效，椿皮中含有苦木素、生物碱、甾醇、萜类等多种化学成分，其中生物碱作为主要活性成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性，是近年来研究的重点，相对于其他植物，椿皮中的生物碱含量较低，目前研究主要集中在分离鉴定及生物活性等方面，而对于其定量测定研究还鲜见报道[1-4].为此，以椿皮中特征性生物碱成分铁屎米-6-酮为测定指标，探索利用HPLC的方法测定其在椿皮中的含量，以期为药材椿皮的质量控制及评价提供参考.

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Autobalance AD6000型超微量天平;FL2200Ⅱ型高效液相色谱仪;SB-5200DNT型超声波清洗机;RE-52A型旋转蒸发仪;GWA-UN5-30型超纯水器;Eppendorf微量移液器.

1.2 试剂

铁屎米-6-酮对照品（批号20170312，购自宝鸡市辰光生物有限公司，纯度为98%）;乙腈为色谱纯;冰乙酸为分析纯;超纯水自制.椿皮购于安徽亳州药材市场（经赤峰学院刘铁志教授鉴定为植物臭椿的干燥茎皮）.

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取铁屎米-6-酮生物碱1.0963mg，以甲醇定容至5mL制成对照品溶液，4℃储存备用.

2.2 供试溶液的制备

精密称取过100目筛的椿皮粉末3.0000g，置于250mL的具塞锥形瓶中，加入100mL的无水甲醇后超声提取1h，过滤，洗涤3次，将滤液及洗涤液进行减压浓缩，定容到50mL，得供试溶液.

2.3 色谱条件的确定

色谱条件：色谱柱：Ultimate AQ-C18（250mm×4.6mm，5μm）;流动相：乙腈-0.1%乙酸（35：65）;检测波长：254nm;流速：1.0mL·min-1;柱溫：30℃;进样量：20μL.

依次吸取对照品溶液、供试溶液在上述色谱条件下检测，对照品及供试品HPLC图见图1.供试溶液中其他色谱峰对铁屎米-6-酮色谱峰无干扰，理论塔板数21098，分离度1.739，拖尾因子0.977，与基线分离完全，符合含量测定的要求.因此，以下色谱检测试验都按照上述色谱条件进行.

2.4 线性关系考察

精密吸取对照品溶液，以甲醇配制成1.10～15.35μg·mL-1的系列浓度溶液，进行色谱检测，以峰面积Y与进样浓度X（μg·mL-1）进行线性回归，得回归方程：Y=10026.516+70252.688X（r=0.9994）.表明铁屎米-6-酮生物碱进样浓度在1.10～15.35μg/mL的范围内与峰面积线性关系良好.

2.5 精密度试验

利用对照品溶液进行精密度试验，重复6次，记录铁屎米-6-酮每次的峰面积，计算RSD值，结果铁屎米-6-酮的峰面积RSD值为0.65%，表明仪器的精密度较好.

2.6 重复性试验

精密称取椿皮药粉，按照“2.1”方法制备供试溶液，按照“2.3”项下条件进样6次，记录铁屎米-6-酮每次的峰面积，计算RSD值，结果铁屎米-6-酮的峰面积RSD值为0.64%，表明该方法的重复性较好.

2.7 稳定性试验

配制一份供试溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、24 h后进行色谱分析，记录铁屎米-6-酮每次的峰面积，通过计算，得到RSD值为1.54%，说明供试溶液在24h内稳定.

2.8 加样回收率试验

精密称取6份椿皮药粉，每份3.0000g，并加入一定量的铁屎米-6-酮生物碱标准品，按“2.1”方法制备供试溶液，进行色谱检测，计算回收率（n=6），见表1.结果显示铁屎米-6-酮的平均回收率为99.66%，RSD值为1.38%.

2.9 样品测定

精密称取3个不同批次的椿皮样品，按“2.1”方法制备供试溶液，进行含量测定，结果显示样品中铁屎米-6-酮生物碱含量在14.11～33.24μg·g-1之间，同批次样品铁屎米-6-酮生物碱含量较稳定，不同批次间含量存在较大差异.

3 讨论

通过全波长扫描，铁屎米-6-酮生物碱在210nm处有末端吸收，在250nm附近也有最大吸收，为避免溶剂峰及杂峰的干扰，参照文献[5]使用254nm作为其检测波长.

采用文献[6-7]乙腈-0.2%氨水溶液（22∶78）、乙腈-0.1%磷酸（35∶65）作为流动相来测定椿皮中的铁屎米-6-酮生物碱，结果显示分离效果不佳.参照文献[8]采用乙腈-0.1%乙酸水溶液为流动相，先后考察了乙腈-0.1%乙酸水溶液不同配比（95∶5～15∶85）对铁屎米-6-酮生物碱分离效果的影响，发现乙腈-0.1%乙酸水溶液（35∶65）、乙腈-0.1%乙酸水溶液（25∶75）都能与其他峰的基线达到完全分离，但考虑到以乙腈-0.1%乙酸水溶液（25∶75）为流动相时，铁屎米-6-酮生物碱保留时间过长，为提高分析效率，故采用乙腈-0.1%乙酸水溶液（35∶65）作为流动相进行分离.

通过比较不同柱温（25℃、30℃、35℃、40℃）下铁屎米-6-酮生物碱分离效果，并对其HPLC色谱图进行综合分析，发现柱温30℃时基线稳定，分离效果较好，故选择柱温30℃为液相色谱条件.

对药材市场购买的不同批次椿皮药材，利用此种方法对铁屎米-6-酮生物碱含量进行检测，发现其含量在14.11～33.24μg·g-1之间，含量变化较大，这可能与药材的产地、采收时节、生长环境、存储加工等因素存在较大的关系.

以上建立的测定方法，具有良好的精密度和简便性，对椿皮药材中特征性生物碱成分铁屎米-6-酮的含量检测提供了一定的科学依据和参考.但此种方法仅是对一种铁屎米酮型生物碱的含量测定，而对于椿皮中多种生物碱成分含量的同时测定，还需要进一步的研究.

参考文献：

〔1〕谭庆伟，吴祖建，欧阳明安.臭椿化学成分及生物活性研究进展[J].天然产物研究与开发，2008（4）：748-755.

〔2〕胡苗芬，宋新波，张丽娟.臭椿吲哚生物碱成分及其生物活性研究进展[J].药物评价研究，2012，35（6）：469-472.

〔3〕錢娟，王瑞平，邹玺.椿皮的化学成分及抗肿瘤作用研究进展[J].江苏中医药，2012，44（4）：75-77.

〔4〕李永春，赵美荣，李晓兰，等.臭椿主要活性成分及在生物防治中的应用[J].湖南农业科学，2018（3）：118-122.

〔5〕赖正权，欧国灯，肖树雄，等.HPLC法同时测定苦木注射液中3种活性成分的含量[J].药物分析杂志，2011，31（1）：15-18.

〔6〕黄晓丹，苏子仁，沈小玲，等.消炎利胆片中穿心莲内酯类和苦木碱类的RP-HPLC法测定[J].中成药，2003（6）：21-24.

〔7〕吕武清，黄卫东，宋友昕.HPLC法测定苦木药材中铁屎米酮生物碱[J].中草药，2009，40（8）：1321-1323.

〔8〕赵文娜，余静洁，张新新，等.RP-HPLC法测定苦木药材中4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮的含量[J].药物分析杂志，2012，32（7）：1239-1242.

收稿日期：2019-12-18

基金项目：内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZY19215）

通讯作者：张智，教授，从事植物资源开发与利用研究