加味香砂六君子汤对胃癌大鼠的实验研究

高华娟 黄小靖 郭丽宏 何文胜

摘要 目的：探究并分析加味香砂六君子湯通过抑制Wnt信号通路对胃癌大鼠桩蛋白（paxillin）、大鼠凋亡相关蛋白（RelA）表达的影响。方法：选取健康成年Wistar大鼠120只，按照随机数字表法分为对照组和观察组，每组60只，对2组大鼠进行胃癌造模处理，对照组大鼠又随机分为未处理组、处理（生理盐水）后8周组、处理（生理盐水）后12周组，每组20只。观察组大鼠又随机分为未处理组、处理（汤药）后8周组、处理（汤药）后12周组，每组20只。观察2组大鼠处理前、处理后8周、处理后12周paxillin、RelA。结果：2组大鼠处理前后体质量差异有统计学意义（P<0.05），2组大鼠处理前体质量比较差异无统计学意义（P>0.05），处理后，2组大鼠体质量有所降低，但观察组大鼠降低程度明显小于对照组（P<0.05）;2组大鼠处理前后wnt-1、paxillin、RelA水平差异有统计学意义（P<0.05），2组大鼠处理前wnt-1、paxillin、RelA水平比较差异无统计学意义（P>0.05），处理后，2组大鼠wnt-1、paxillin、RelA水平呈降低趋势，但观察组大鼠wnt-1、paxillin、RelA水平明显小于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：加味香砂六君子汤能有效通过抑制wnt以降低胃癌大鼠paxillin、RelA的表达。

关键词  胃癌;大鼠;桩蛋白;大鼠凋亡相关蛋白;加味香砂六君子汤;信号通路;体质量;表达

Effect of Jiawei Xiangsha Liujunzi Decoction on Gastric Cancer Rats

GAO Huajuan¹， HUANG Xiaojing²， GUO Lihong¹，HE Wensheng¹

（1 fujian college of bioengineering， Fuzhou 350007， China; 2 Department of general surgery， fuzhou first hospital， Fuzhou 350000， China）

Abstract Objective：To explore and analyze the effect of Jiawei Xiangsha Liujunzi Decoction on the expression of paxillin （post protein） and RelA （apoptotic related protein） in gastric cancer rats by inhibiting Wnt signaling pathway.Methods：120 healthy adult Wistar rats were randomly divided into control group and observation group， 60 rats in each group.Gastric cancer modeling treatment were done for 2 groups of rats.Rats in control group were randomly divided into untreated group， 8 weeks after treatment （saline） group and 12 weeks after treatment （saline） group， 20 rats in each group.The rats in the observation group were randomly divided into untreated group， 8 weeks after treatment （decoction） group and 12 weeks after treatment （decoction） group， 20 rats in each group.Paxillin and RelA were observed before treatment， 8 weeks after treatment and 12 weeks after treatment of the two groups.Results：There was significant difference in the quality of rats between the two groups before and after treatment （P<0.05）.There was no significant difference in the quality of rats between the two groups before treatment （P>0.05）.After treatment， the quality of rats in the two groups decreased， but the degree of reduction in the observation group was significantly lower than that in the control group （P<0.05）.The levels of wnt-1， paxillin and RelA in the two groups before and after treatment were significantly different （P<0.05）.There was no significant difference in the levels of wnt-1， paxillin and RelA between the two groups before treatment （P>0.05）.After treatment， the levels of wnt-1， paxillin and RelA in the two groups decreased， but the levels of wnt-1， paxillin and RelA in the observation group were significantly lower than those in the control group （P<0.05）.Conclusion：Jiawei Xiangsha Liujunzi Decoction can effectively inhibit the expression of paxillin and RelA in gastric cancer rats by inhibiting wnt.

Keywords Gastric cancer; Rat; Pile protein; Rat apoptosis-related protein; Jiawei Xiangsha Liujunzi Decoction; Signaling pathway; Quality; Expression

中图分类号：R285.5 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.08.009

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位，胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高[1]。近年来，随着人们生活节奏的加快以及生活压力的逐渐增大，消化道肿瘤的发病率呈上升趋势[2]。目前，胃癌的主要治疗方式就是手术治疗，但是对于部分尚未达到手术指针或者无法耐受手术的患者，药物有着重要的治疗作用。加味香砂六君子汤是一味常用的中药，由党参、白术、茯苓、陈皮等组成[3]。消化性溃疡（胃及十二指肠溃疡）、胃炎合并上消化道出血是中医内科学常见的病症，属中医内科“胃脘痛”“血证”的范畴。此外，加味香砂六君子汤对于脘腹胀满、隐痛、嗳气、泛酸、畏寒怯冷、便溏、便频等症状也有较好的效果。近来，有動物实验发现，加味香砂六君子汤能有效调控大鼠胃黏膜癌症相关因子的表达，可能有助于癌症的治疗[4]。为此，我们将加味香砂六君子汤用于胃癌模型大鼠的处理中，望探究其对胃癌大鼠的影响，现将报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康成年Wistar大鼠120只（清洁级，体质量180～220 g），使用C060灭菌的商品化大鼠饲料，自由饮水采食，自然光照，饲养温度18～]25 ℃，饲养湿度60%～70%。本实验通过医学伦理学审查（伦理审批号：1702234）

1.1.2 药物 加味香砂六君子汤配方：太子参]50 g、白术50 g、茯苓50 g、半夏50 g、陈皮50 g、木香50 g、甘草50 g、砂仁50 g、黄芪30 g、竹茹30 g、刺五加30 g、半枝莲10 g、莪术10 g，共计510 g。配自辽宁中医药大学附属第一医院药局，生产批号：H2182322。

1.1.3 试剂与仪器 N-甲基-N-亚硝基-N-硝基胍（MNNG，购自日本东京化成工业株式会社，批号：h2173722）;雷尼替丁（江西汇仁药业有限公司，批号：yn18392ag007）。维酶素片（北海阳光药业有限公司，批号：yg166304）。兔抗人PTEN（批号：1862831）、FAK（批号：18239G04）、paxillin单克隆抗体（批号：72160703-8）购于ABcam公司;Anti-PTEN抗体（批号：1727se18329），Anti-FAK抗体（批号：Y22173829N），Anti-paxillin抗体（批号：1626173HX301），通用型SP试剂盒SP-9000（批号：36268319），DAB显色试剂盒（批号：H237623812）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将Wistar大鼠120只按照随机数字表法将其分为对照组和观察组，对2组大鼠进行胃癌造模处理，对照组大鼠又随机分为未处理组、处理（生理盐水）后8周组、处理（生理盐水）后12周组，每组20只。观察组大鼠又随机分为未处理组、处理（汤药）后8周组、处理（汤药）后12周组，每组20只。大鼠之间体质量差异无统计学意义，进食状态正常。造模方法：造模方法参考等人在研究[5]中的造模方法进行造模，造模处理2个月。

1.2.2 给药方法 观察组大鼠中未处理组直接处死。处理8周以及12周组大鼠给予加味香砂六君子汤10 g/kg，疗程分别为8周以及12周，并分别于8周及12周处死。加味香砂六君子汤采取常规煎法，共煎出药液200 mL，浓缩至100 mL（配置成生药浓度为5 g/mL的水煎膏）。10 mL/瓶，高压（0.1～0.15 kPa）20 min灭菌后，于4 ℃冰箱保存备用。对照组大鼠（未处理组）直接处死，其余大鼠给予生理盐水1 mL灌胃（0.5 g/kg），1次/d，处理8周以及12周组大鼠分别于8周以及12周处死。

1.2.3 检测指标与方法 所有大鼠处死后对胃癌组织进行活检，并送病理检查。胃黏膜Wnt信号通路关键因子Wnt-1采用Real Time PCR技术检测，Paxillin、RelA表达采用免疫组化法测定，RelA水平采用平均光密度表示。实验室检查由我院两名检验科人员操作，试验相关试剂及试剂盒由我院中心实验室提供。观察2组大鼠处理前、处理后8周、处理后12周质量、wnt-1表达、paxillin、RelA表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。经统计分析，所得数据均符合正态分布。采用t检验以及重复方差分析统计计量资料;采用卡方检验统计计数资料，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组大鼠质量比较 2组大鼠处理前后体质量差异均有统计学意义（P<0.05），2组大鼠处理前体质量比较差异无统计学意义（P>0.05），处理后，2组大鼠体质量呈下降趋势，但观察组大鼠体质量明显大于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 2组大鼠wnt-1表达比较 2组大鼠处理前后wnt-1差异有统计学意义（P<0.05），2组大鼠处理前wnt-1比较差异无统计学意义（P>0.05），处理后，2组大鼠wnt-1呈降低趋势，但观察组大鼠wnt-1明显小于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 2组大鼠paxillin水平比较 2组大鼠处理前后paxillin水平差异有统计学意义（P<0.05），2组大鼠处理前paxillin水平比较差异无统计学意义（]P>0.05），处理后，2组大鼠paxillin水平呈降低趋势，但观察组大鼠paxillin水平明显小于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3，图1。

2.4 2组大鼠RelA水平比较 2组大鼠处理前后RelA水平差异有统计学意义（P<0.05），2组大鼠处理前RelA水平比较差异无统计学意义（P>0.05），处理后，2组大鼠RelA水平呈降低趋势，但观察组大鼠RelA水平明显小于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4，图2。

3 讨论

香砂六君子汤由党参、白术、茯苓、炙甘草、陈皮、制半夏、广木香、砂仁所组成，曾改名为健脾和胃汤[6]。该方重点和胃畅中，治疗脾胃虚弱、脘腹胀满、隐痛、嗳气、泛酸等症。目前常用于治疗消化性溃疡、胃炎等，本方如加黄芪，以参、芪补气摄血;加炮姜，温中止血，《本草经读》：“中者土也，土虚则寒，而此能温之[7]。止血者，以阳虚则阴必走，得暖则血自归经也”。香附有行血中之气，止血而不留瘀。本方益气健脾统血，温胃散寒止血，临床运用效果确切，且能治疗脾胃虚寒诸症，增强脾胃运化功能。为此，笔者将其用于胃癌大鼠并探究其对胃癌大鼠的肿瘤相关指标表达的影响。

Wnt信号传导途径是一组信号转导途径，其以蛋白质开始，所述蛋白质通过细胞表面受体将信号传递到细胞中[8-9]。Wnt信号途径用的只有2种信号传导方式：胞间交流（旁分泌）或者相同细胞的交流（自分泌）。这些信号通路都在动物中在遗传上是高度保守的，这也意味着它们在动物种间时很相似的。

Paxillin是一种蛋白质，在人类由编码PXN基因。Paxillin在表达黏着斑非横纹肌细胞中，并在costameres的横纹肌细胞，以及其功能是黏附细胞的细胞外基质。PXN基因的突变以及Paxillin的异常表达与各种癌症的进展有关。Paxillin已被证明在几种癌症类型的患者中具有临床重要作用[10-11]。Paxillin的增强的表达已在癌前区域被检测增生，鳞状化生和杯状细胞化生，以及发育异常的病变和癌的高风险患者的肺腺癌。RELA，也称为p65，是参与NF-κB异二聚体形成，核转位和活化的REL相关蛋白。RELA的磷酸化和乙酰化是NF-κB活化所需的关键翻译后修饰，RELA也被证明可以调节免疫反应，RELA的激活与多种类型的癌症正相关。作为NF-κB的原型异二聚体复合物成员，与p50一起，RELA在经典NF-κB活化和核转位过程中与细胞质和细胞核中的各种蛋白质相互作用。

本研究中，2组大鼠处理前后质量差异有统计学意义（P<0.05），2组大鼠处理前质量比较差异无统计学意义（P>0.05），处理后，2组大鼠质量呈下降趋势，但观察组大鼠质量明显大于对照组（P<0.05），此结果表明，加味香砂六君子汤能有效改善胃癌大鼠消化功能，减少大鼠体质量的下降。能有效降低胃癌大鼠paxillin、RelA的表达。You等[15]也在研究得出相似结论，这有可能与wnt信号通路的抑制有关。Cho等[14]也在研究中发现，加味香砂六君子汤能有效增加大鼠体质量，可能与改善大鼠消化功能有关。

本文證实了加味香砂六君子汤可以通过抑制Wnt信号通路影响胃癌大鼠paxillin、RelA的表达，为胃癌的病理生理学研究提供了相关研究证据。本文也有不足之处，如样本数量，若需进一步研究加味香砂六君子汤对胃癌大鼠病理生理的影响，需要更大的样本量的支持。

参考文献

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