传染性单核细胞增多症儿童外周血中TLR9 mRNA及γδ-TCR型DNT细胞的表达*

吴振奎， 钟丽花， 刘延霞， 刘玉玲

(1.海南现代妇女儿童医院 儿科， 海南 海口 571100； 2.海南省妇女儿童医学中心 儿科， 海南 海口 570208)

儿童传染性单核细胞增多症(IM)是原发EB病毒(EBV)感染的常见形式，IM感染多发生在儿童群体，大多数儿童被感染后呈现隐性性状，无特异性临床表现，确诊难度较大[1-2]。IM的发病机制尚不明确，但其与机体免疫平衡紊乱密切相关，探讨免疫相关物质与IM间的关系，有助于临床IM的诊断及了解IM的致病机制[3-4]。天然免疫系统中的细胞可表达模式识别受体(PRR)，PRR主要用于识别病原体结构，Toll受体(TLR)是一类PRR，TLR9主要表达在B淋巴细胞表面，EBV病毒被证实为TLR9配体，能激活淋巴细胞上TRL9，诱发抗病毒反应[5-6]。人类胸外免疫组织及器官中存在一种双阴性T细胞(DNT)，其在抗病毒、自身免疫及器官移植中均具有重要作用[7]。本研究以90例IM患儿作为研究对象，分析其入院时外周血淋巴细胞表型、TLR9 mRNA及(γ+δ)+TCR型DNT细胞表达水平变化，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月—2020年1月收治的90例IM患儿作为研究对象，患儿均符合儿童EB病毒IM相关诊断标准[8]：临床症状至少3项阳性(发热、咽炎、扁桃体炎、颈部淋巴结肿大、肝脏肿大、脾脏肿大、皮疹)、血象检测中≥5岁患儿白细胞分类的淋巴细胞占比50%以上或淋巴细胞总数>5.0×109/L，异型淋巴细胞达10%以上或总数>1.0×109/L；EB病毒抗体或EB病毒DNA检查阳性。根据患儿病情，将患儿分为急性期组(n=50)与恢复期组(n=40)；急性期组患儿均为首次发病、未使用糖皮质激素或细胞毒性药物治疗、未使用免疫调节剂治疗，恢复期组为经治疗1个月后、临床复查提示临床症状及体征消失的患儿。同时选取30例同期体检健康的同龄患儿作为对照组。IM患儿于入院时、对照组儿童于体检当日抽取外周血，进行后续研究。

1.2 方法

1.2.1淋巴细胞表型分析 取3组儿童EDTA-K2抗凝的外周血3份，分别加入3支流式管中，在3支流式管中再各加入CD3-PECY5/CD4-FITC/CD8-PE 10 μL、CD3-PECY5/CD19-FITC 10 μL、CD3-FITC/CD(16+56)+PE 10 μL，充分混匀，25 ℃避光孵育20 min，加入OptiLyse C免洗溶血素250 μL，混匀静置20 min，1 200 r/min离心5 min，去除上层血清，PBS缓冲液冲洗2次，加入PBS缓冲液500 μL悬浮细胞，流式细胞仪检测10 000个淋巴细胞，流式数据分析及作图使用EXPO32 ADC Analysis软件。

1.2.2TLR9 mRNA表达水平 采用实时荧光定量PCR检测，取3组儿童EDTA-K2抗凝的外周血5 mL，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMNC)待用。设计并合成TLR9基因的上游引物序列为5′-CAGGACAACCACCACTTCT-3′，下游引物序列为5′-AGCCTTCGGTAGCATTTATTC-3′，目的片段大小为194 bp；以hGAPDH作为内参基因，上游引物序列为5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物序列为5′-GAAGAGGGTGATGGGATTTC-3′，目的片段大小为266 bp。试剂盒为SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，仪器为ABI 7900HT Fast Real-Time PCR system仪，PCR扩增反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s，40个循环，采用参照基因作为标准进行相对定量△CT法计算目的基因相对表达量。

1.2.3DNT细胞表型分析 取3组儿童EDTA-K2抗凝的外周血50 μL加入流式管，加入CD3-PECY5/CD4-FITC/PAN(α+β)TCR-PE 10 μL，充分混匀，25 ℃避光孵育20 min，加入OptiLyse C免洗溶血素250 μL，混匀静置20 min，1 200 r/min离心5 min，去除上层血清，PBS缓冲液冲洗2次，加入PBS缓冲液500 μL悬浮细胞，流式细胞仪检测10 000个淋巴细胞，使用EXP032 ADC XL4 Color软件获取数据，分别字前向散射光及侧向散射光点图中圈选出淋巴细胞，使用CD3设计，进一步在CD3+细胞中分析DNT细胞比例，流式数据分析及EXPO32 ADC Analysis软件作图。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 外周血淋巴细胞分型

结果显示，3组儿童外周血CD3+、CD3+CD8+水平比较，急性期组>稳定期组>对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；外周血CD3+CD4+、CD4/CD8、CD3-CD(16+56)+及CD3-CD19+水平比较，急性期组<稳定期组<对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组儿童外周血淋巴细胞分型比较Tab.1 Comparison of lymphocyte typing in the peripheral blood among three groups

2.2 外周血TLR9 mRNA表达水平

结果显示，3组儿童外周血TLR9 mRNA表达水平比较，急性期组>稳定期组>对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组儿童外周血TLR9 mRNA表达水平比较Tab.2 Comparison of expression level of TLR9 mRNA in peripheral blood among three

2.3 外周血DNT细胞表型

结果显示，对照组、稳定期组及急性期组外周血中均有DNT细胞表达，为(γ+δ)+TCR型，且3组儿童外周血中(γ+δ)+TCR型DNT占比，急性期组>稳定期组>对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组儿童外周血DNT细胞表型Tab.3 Phenotype of DNT cell in peripheral blood

3 讨论

IM是一种单核-巨噬细胞系统急性增生性传染病，该疾病主要由EBV感染所致，EBV感染后可侵犯机体淋巴系统，主要临床表现为发热、咽峡炎、颈淋巴结肿大，称之为三联征[9-11]。目前，IM诊断结合临床表现与实验室检查结果做出最终判断，但部分患儿在EBV原发感染后，大多数无症状，表现为隐性或轻型发病，外周血中异型淋巴细胞、特异性IgM检测阳性率低，故在诊断IM时，需结合多种实验室指标，并仔细分析患儿临床表现。

IM发病机制尚不明确，但有大量研究发现，疾病的发生与患儿机体免疫机制失衡密切相关。IM急性期，其CD3+、CD8+水平明显升高，CD3+CD4+、CD4+/CD8+水平明显降低，存在明显的CD4+/CD8+失衡[12-13]。本研究中，IM稳定期及急性期患者外周血CD3+、CD3+CD8+水平明显高于健康对照组，CD3+CD4+、CD4/CD8、CD3-CD(16+56)+、CD3-CD19+水平明显低于健康对照组，与上述研究结论一致。

病毒在体内的生存与复制取决于宿主抗病毒机制，天然免疫系统相关细胞可表达PRR，以识别病原体结构成分(PAMP)，TLR就是一类PRR[14-15]。TLR家族成员较多，其中TLR(2、3、4、7、8、9)能识别病毒，TLR(3、7、8、9)还可作为胞内受体[16-17]。有研究发现，TLR能外源性及内源性分子，并鉴别内源性大分子降解产物，提示TLRs参与了组织损伤、感染等病理生理过程。TLR9主要表达于B淋巴细胞表面，可被含非甲基化的CpG寡脱氧核苷酸激活，在促使B淋巴细胞分化、增殖及活化过程中发挥功效，EBV是TLR9配体，可激活淋巴细胞上的TLR9，进而产生抗病毒的细胞因子[18-19]。EBV可通过TRL9途径激活炎症反应，导致IL-8释放增多，动物实验发现，TRL9缺陷小鼠具有更高的病毒滴度，其死亡风险也更高，提示TLR9在抗DNA病毒的免疫应答中具有重要作用，TLR9可诱导CD4+CD25+细胞与CD4+CD25-细胞证实，削弱Treg抑制活性，TLR9配体通过扩增效应T细胞与抑制CD4+CD25+Treg功能，以增强宿主适应性免疫反应[20]。本研究中，IM稳定期及急性期IM患儿血TLR9 mRNA水平均显著高于健康对照组，而急性期IM患儿TLR9 mRNA水平较稳定期患儿上调，提示在IM急性期，病毒侵入机体后，TLR9表达上调以识别病原体，同时诱导机体开启免疫机制，另一方面，TLR9表达上调能导致CD4+CD25+Treg抑制功能下降，进而加强机体免疫功能，利于病原体清除[21-23]。

大部分淋巴细胞是在胸腺发育成熟后成为表面标志的CD4+或CD8+单阳性T细胞，但体内依旧存在少量DNT[24]。DNT表达量低，在抗病毒、肿瘤免疫等方面发挥功效，有研究还表示，DNT细胞在自身免疫及器官移植中均具有免疫调节作用。DNT的表达是机体抑制病毒特异性CD8+T细胞的免疫调节机制，同时对机体自身抗病毒具有协同作用。但目前，关于CNT细胞的来源仍不清楚，有研究发现，IL-2能促进转化的DNT细胞增殖，DNT细胞对细胞经成熟树突状细胞刺激后将呈低反应性，IL-2则可完全恢复其体外反应性，提示IL-2提高了DNT细胞对细胞的凋亡的抵抗力[25]。本研究发现，IM患儿出现特异性高表达(γ+δ)+TCR型DNT，对临床诊断IM提供依据。

综上所述，IM患儿机体免疫机制失衡，TLR9表达上调，并出现特异性(γ+δ)+TCR型DNT水平升高，其在诊断IM中具有重要价值。