固定化法枸杞葡萄皮渣醋的发酵工艺探讨

张存智，刘晶，张宏，赵建华

(1.宁夏职业技术学院，银川 750021；2.宁夏农业学校，银川 750021；3.宁夏农林科学院，银川 750002)

在葡萄酿酒过程中，产生大量的皮渣副产物，约占葡萄加工量的25%～30%。在新鲜红葡萄皮渣中，含有花色素类、白藜芦醇、黄酮类、酵母自溶物质等多种有效成分，具有抗氧化、降低血脂胆固醇、软化血管、抗癌抑癌、美容养颜之功效。目前我国绝大多数的葡萄皮渣得不到有效利用，一般作为饲料、肥料，甚至垃圾处理，资源综合利用率很低[1-3]。枸杞中富含枸杞多糖、甜菜碱等有效成分，具有提高免疫力、抗衰老、抗肿瘤、保肝等保健作用[4,5]。

果醋被誉为“第四代饮料”，通常是以葡萄、苹果和桑葚等水果或果品加工的下脚料为主要原料，经酒精发酵、醋酸发酵酿造而成[6]。徐敏[7]利用葡萄皮渣酿造果醋，李彩霞等[8]利用葡萄和枸杞酿造复合果醋，但以压榨后常温保存的新鲜葡萄皮渣和干枸杞微粉复配进行枸杞葡萄醋工艺研究未见报道。液态固定化法酿造果醋也有报道[9-12]，但以玉米芯为固定化载体进行枸杞葡萄醋工艺研究未见报道。

本研究以室温保存的新鲜葡萄皮渣和干枸杞微粉为原料，以玉米芯为固定化载体，采用固定化法醋酸液态发酵工艺，研究皮渣的新鲜度、枸杞微粉添加量对皮渣酒液和醋液酚类物质含量及醋感官品质的影响，以及不同工业醋酸菌菌种筛选，为高效利用葡萄皮渣，简化果醋发酵工艺提供了理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干枸杞：宁夏山里红生物科技有限公司中宁特级枸杞。

葡萄皮渣1：2017年，玉泉营“美乐”葡萄正常发酵，残糖4 g/L，螺旋压榨，干重为33.8%(100 g的皮渣在40 ℃下烘干3 h后的重量)。

葡萄皮渣2：2017年，玉泉营“美乐”∶玫瑰香为3∶1，葡萄正常发酵，留糖53 g/L，用气囊压榨机压榨，压力为0.4个大气压，皮渣放置2 d后，干重为24.66%。

活性醋酸菌：济宁玉园生物科技有限公司活性醋酸菌。本品以AS1.41、沪酿1.01为原种，混合液体培养，真空浓缩，吸附干燥而成。

果醋菌：烟台帝伯仕自酿机有限公司。

主要试剂：无水碳酸钠、F-C试剂(福林酚)、2-辛醇等分析纯试剂；Biosystem花青素、多酚等试剂盒；芦丁标准试剂。

辅料：白砂糖，市售；无菌洁净晒干玉米芯。

1.2 仪器与设备

722S可见分光光度计 上海精密仪器仪表有限公司；普析TU-1901双光率紫外可见分光光度计；Y15葡萄酒快速分析仪 西班牙Biosystem公司；粉碎粒度可调的粉碎机；8 L玻璃瓶。

1.3 方法

1.3.1 葡萄皮渣酒精发酵和醋酸发酵方法

醋酸菌、果醋菌活化方法：按重量比1∶10的比例将菌接种待醋酸发酵的酒液中,摇床培养30 min，转速120 r/min,温度在25～35 ℃。

皮渣酒精发酵：皮渣2在密封罐中存放4，6，8，10 d，加糖，使葡萄醪的比重在1050～1055，加入破碎的枸杞，进行酒精发酵，结束后的酒精度在6.5% 左右。

皮渣酒精发酵结束后，皮渣分离，酒液加入到玻璃瓶中，瓶中装好灭菌的玉米芯，酒液高度以刚好浸没玉米芯为宜，然后分别加入活化的果醋菌和醋酸菌进行醋酸发酵，接种量10%。循环喷淋，循环量0.5 L/min，发酵温度为28～35 ℃，发酵3 d后，测总酸的变化情况，检测醋酸发酵进程。当总酸不再上升或者开始下降时，发酵时间为15～20 d，加入0.4 g/L的食盐，防止醋酸氧化，对容器进行封口处理，满罐贮存。

1.3.2 枸杞不同粉碎粒度的影响

将枸杞利用粉碎粒度可调的粉碎机进行粉碎，分别过50，100，200目的筛网，筛选枸杞不同粉碎粒度对试验难易程度的影响。

1.3.3 葡萄皮渣不同新鲜度对酒中和醋中酚类物质含量的影响

将皮渣1放置于30 L不锈钢罐中，封闭保存，分别取在罐中放置不同时间2，4，6，8，10 d的皮渣，酒精发酵后，检测葡萄皮渣不同新鲜度对酒中和醋中酚类物质含量的影响。

将皮渣2放置于30 L不锈钢罐中封存，在6，8，10 d后启动酒精及醋酸发酵，菌种为果醋菌，检测葡萄皮渣不同新鲜度对醋中酚类物质含量的影响。

1.3.4 枸杞不同添加量对醋感官质量和多糖、黄酮含量的影响

取破碎50目的枸杞2，4，6 g/L和0，2，3，4 g/L两组，分别加入11倍的去离子水，加入果胶酶20 mg/L，在(41±3) ℃水浴中水浴处理3 h后，加入到存放4 d的皮渣2中，在玻璃瓶中进行酒精和醋酸发酵。2，4，6 g/L处理,醋酸发酵结束7 d后进行感官分析。0，2，3，4 g/L处理，发酵结束后30 d后进行醋酸多糖和黄酮含量的检测。

1.3.5 不同菌种对感官质量的影响

存放8 d的皮渣2，加入50目过筛枸杞4 g/L，酒精发酵结束后，分别加入果醋菌和醋酸菌进行醋酸发酵，发酵结束7 d进行感官质量分析；存放30 d后，检测总酸、L-苹果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸在添加不同醋酸菌的果醋中的含量。

1.3.6 检测方法

L-总糖、总酸、酒精度、pH采用GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定。

M-苹果酸、乳酸、柠檬酸、总糖、多酚、花色苷、单宁、花青素、总糖透光率的测定：采用分光光度法。

N-感官指标检测：10人品鉴小组(都具有品鉴经验)。

2 结果分析

2.1 枸杞不同粉碎粒度对试验难易程度的影响

枸杞含有糖和果胶，当枸杞的粉碎粒度为200目时，枸杞容易发粘，呈块状，难以均匀分离。枸杞粉碎到100目时，果肉粉碎了，但是枸杞籽不易粉碎；过筛时，容易将果肉和枸杞籽分离，造成浪费。粉碎成50目过筛，破碎的果肉和枸杞籽都可以通过筛孔。因此，枸杞的粉碎粒度以50目为宜。

2.2 葡萄皮渣不同新鲜度对酒中和醋中酚类物质含量的影响

2.2.1 葡萄皮渣1不同新鲜度对葡萄酒中花色苷和单宁含量的影响

图1 葡萄皮渣不同新鲜度对葡萄酒中花色苷和单宁含量的影响Fig.1 Effect of different degrees of freshness of grape peel residues on the content of anthocyanins and tannins in red wine

由图1可知，皮渣压榨后，存放2，4，6，8，10 d，皮渣酒精发酵后得到的葡萄酒中，花色苷和单宁在2 d时最高，达到572.67 mg/L和1778.57 mg/L，之后随着贮藏天数增多，花色苷从572.67 mg/L降低到6 d的138.58 mg/L,降低了75.8%；单宁从1778.57 mg/L降低到6 d的464.29 mg/L，降低了74.9%；两者均在6 d后速度减慢，10 d后单宁含量仅是2 d的16.5%；花色苷是10.2%。所以，当葡萄酒发酵结束、皮渣分离后，尽快进行葡萄酒醋的加工，皮渣放置的时间越长，有效成分损失的越多。

2.2.2 葡萄皮渣2不同新鲜度对醋中花青素、多酚和黄酮含量的影响

图2 葡萄皮渣不同新鲜度对醋中花青素、多酚、黄酮含量的影响Fig.2 Effect of different degrees of freshness of of grape peel residues on the content of anthocyanins, polyphenols and flavonoids in vinegar

由图2可知，葡萄皮渣2存放的时间越长，果醋菌酿成果醋花青素、多酚、黄酮含量逐渐降低，8 d后降低至接近最低，花青素含量由6 d的23 mg/L下降到4 mg/L，下降了82.6%，多酚含量由6 d的1320 mg/L下降到420 mg/L，下降了68.1%，黄酮含量由6 d的1.54 mg/L下降到0.33 mg/L，下降了78.6%。醋中酚类物质含量的降低与皮渣酒中结果一致。

2.3 枸杞不同添加量对醋感官质量和多糖、黄酮含量的影响

2.3.1 枸杞不同添加量对醋感官质量的影响

由表1可知，随着枸杞添加量的增加，醋的颜色变浅，有可能是枸杞中黄酮和类胡萝卜素影响醋的颜色。加入枸杞6 g/L的醋在口感、香气上欠佳；加入枸杞2 g/L的醋香气好，香气优雅，令人愉悦，但口感不如4 g/L饱满和协调，加入4 g/L为最适宜配方。

2.3.2 枸杞不同添加量对醋多糖和黄酮含量的影响

图3 不同枸杞添加量对醋多糖、黄酮含量的影响Fig.3 Effect of different additive amount of wolfberry on the content of polysaccharides and flavonoids in vinegar

由图3可知，随着枸杞量的增加，黄酮含量和多糖含量都在递增，由对照0.82，9.57 mg/L，递增到4 g/L的2.02，13.08 mg/L，分别递增了2.46倍和1.37倍。由表1可知，枸杞添加量为4 g/L时，感官分析最佳。多糖具有抗肿瘤、增强人体免疫力、降血糖、抗衰老的作用，黄酮具有降血脂、抑制血栓、降血压、雌性激素(异黄酮)以及抗病毒、抑菌、消炎、保肝等功效，从保健作用、感官质量方面综合分析，4 g/L枸杞添加量是最佳选择。

2.4 不同醋酸菌种对醋质量的影响

2.4.1 不同醋酸菌对醋感官品质的影响

存放8 d的皮渣2，加入50目过筛枸杞4 g/L酒精发酵结束后，酒精度为7.23%(V/V)，分别加入果醋菌和醋酸菌进行醋酸发酵，发酵结束7 d进行感官质量分析，品鉴结果见表2。

表2 不同菌种的醋感官分析Table 2 Sensory analysis of vinegar with different bacteria

由表2可知，不同菌种发酵醋的感官质量不同。果醋菌有花香和水果的清香，入口有甜感，刺激性强，酸较柔，回味长，有甜感；醋酸菌具有粮食醋的香气，香气、口感更加浓烈和尖酸。综合评价，果醋菌的醋适宜做醋饮，醋酸菌的醋口感更加厚实，更适宜做调味品。

2.4.2 不同醋酸菌对醋有机酸含量的影响

不同菌种发酵的果醋密封存放30 d后，检测总酸、L-苹果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸在添加不同醋酸菌的果醋中的含量。测得的总酸含量不同，果醋菌总酸含量是6.15 g/dL，醋酸菌总酸含量为6.52 g/dL，有机酸含量也不同，见图4。

图4 不同醋酸菌种有机酸浓度的比较Fig.4 Comparison of organic acid content of different acetic acid bacteria

由图4可知，两种发酵醋中均以柠檬酸为主，含量相同；L-苹果酸、酒石酸、乳酸3种有机酸的含量，醋酸菌都比果醋菌的高，在感官品鉴中，醋酸菌入口更加尖酸。

3 讨论与结论

目前，食醋的生产工艺主要有固态、液态发酵两大类，对于优化固定化菌酿造食醋的工艺参数的研究不多，固定化微生物技术是通过将微生物高度密集地固定在所选载体上，菌体在短时间内快速增殖，增加单位体积中菌体含量和菌液密度，缩短发酵周期，具有发酵效率高、稳定性好、易于实现生产自动化、连续化、菌体可重复利用等优点。通过前期的预备试验，本研究直接将工业醋酸菌用酒液活化，省去菌种在培养基上的扩大培养，以玉米芯为固定化剂，采用喷淋循环通氧，该技术应用在葡萄果醋发酵工艺研究中还未见报道。本研究用皮渣2+糖+枸杞微粉酿造的皮渣酒酒精度为7.23%，不同醋酸菌酿造的醋总酸不同，果醋菌总酸含量是6.15 g/dL，醋酸菌总酸含量为6.52 g/dL，并且有机酸含量也不同，醋酸菌的苹果酸、酒石酸、乳酸含量要高于果醋菌。

试验发现，随着保存时间的延长，压榨后葡萄皮渣中花色苷、单宁含量迅速降低，这与庞志申[13]的研究结果一致，38 ℃储存10 d时，花色苷降解一半。本研究发现葡萄皮渣密封保存6 d的皮渣，酒中单宁和花色苷相比密封保存2 d的分别下降了74.9%和75.8%；10 d后单宁含量仅是2 d的16.5%；花色苷是10.2%。在醋中，黄酮、花青素和多酚的含量下降程度也得出同样的结论。分析原因是葡萄皮渣在压榨过程中，溶解大量的氧气，谢程程[14]研究发现氧化剂可直接亲核进攻花色苷的C位使花色苷开环生成查耳酮，查耳酮进一步降解生成各种无色的酯类物质和香兰素的衍生物。郭耀东[15]研究发现随着温度的升高，葡萄皮花色苷降解速度加快，在光照条件下，花色苷降解速率加快。因此，葡萄皮渣压榨最好用具有氮气保护的气囊压榨机压榨，最好低温、避光、密封保存，并且压榨后的皮渣应尽快处理，不易保存时间过长。

枸杞粉碎目数以50目最佳，枸杞的添加量不是越多越好，枸杞添加量4 g/L为宜。不同醋酸菌对醋的口感和香气有显著的影响，有机酸含量不同，果醋菌更利于生产果醋饮料，醋酸菌更适宜于生产调味品醋。