三氧化二砷抑制人肺癌细胞NCI-H460增殖并促进其凋亡实验研究*

陈正浤，雷光焰，韩 乐，李遂新，徐宗君

1.陕西中医药大学(咸阳 712046)；2.陕西省肿瘤医院胸外科(西安710061)

原发性支气管肺癌是我国及世界范围内发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康[1-2]。三氧化二砷(Arsenic trioxide，ATO)为中药砒石的主要成分，化学式为As2O3，在治疗患有复发性或难治性急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)患者展现出的功效已经令人瞩目[3]。并且研究人员还发现它对其他血液系统恶性肿瘤有效，例如骨髓增生异常综合征，多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤以及某些实体瘤，如肺癌[4]、结肠癌[5]、肝癌[6]、前列腺癌[7]等有治疗作用。

材料与方法

1 实验材料 人大细胞肺癌NCI-H460细胞株购自美国模式培养物保藏库(America type culture collection，ATCC)；注射用三氧化二砷(10 mg/支，批号：20190501)。RPMI-1640培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。BCL2相关蛋白-X(BCL2-Associated X，Bax)、B淋巴细胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Caspase-9)、周期蛋白依赖性激酶-1(Cyclin-dependent kinases，CDK1)、c-Myc兔单克隆抗体购自英国Abcam公司；β-actin单克隆抗体和辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG(二抗)以及CCK-8试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。HERAcell CO2培养箱、生物安全柜(美国，赛默飞公司)；全自动酶标仪(美国，Bio-Tek公司) ;Primo vert倒置显微镜(德国，蔡司公司)；小型垂直电泳仪(美国，BIO-RAD公司);流式细胞仪(美国，BD公司)。

2 实验方法

2.1 细胞培养：人大细胞肺癌细胞株NCI-H460用含有10%的胎牛血清和1%青霉素-链霉素RPMI-1640培养基，置于37 ℃，5% CO2的细胞培养箱中常规培养，每3 d更换1次培养基，待细胞生长至70%～80%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化、传代，取处于对数生长期的细胞进行实验。

2.2 CCK-8法检测As2O3对NCI-H460细胞的增殖：将处于对数生长期的NCI-H460细胞0.25%胰蛋白酶消化，配置成细胞悬液计数，以2×103个/孔的细胞接种于96孔板内；待细胞贴壁后，各组分别加入As2O3(0、2.5、5、10、15、20和 25 μmol/ml)干预，每组设置5个复孔，以生理盐水作为对照组，PBS 作为调零组。在加药后的24、48、72 h每孔分别加入CCK-8溶液10 μl，然后放置细胞培养箱中孵育0.5～1 h，在酶标仪上选择450 nm波长处测量其OD值，计算药物对细胞的增殖抑制率及IC50。抑制率= [(对照孔-实验孔)/(对照孔-空白孔)]×100%。

2.3 集落形成实验：根据CCK-8实验筛选出的半数抑制浓度，分别设置As2O3浓度为5、10和15 μmol/ml组，以生理盐水作为对照组。将As2O3(5、10和15 μmol/ml)作用NCI-H460 24 h后的细胞用0.25%胰蛋白酶消化并配置成单细胞悬液，倍比稀释后接种于6孔板内，每孔接种200个细胞，每组设置3个复孔。加培养液10 ml放置培养箱中继续培养12 d后，培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃去上清液，用PBS浸洗2次，加甲醇固定20 min，弃掉固定液，PBS浸洗2次。加0.1%结晶紫染色液染10～30 min，用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。在光学显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，计算克隆形成率。克隆形成率 =(克隆数/接种细胞数)×100%。

2.4 流式细胞技术检测AS2O3对NCI-H460的细胞周期及凋亡率：分别将不同浓度AS2O3作用NCI-H460 24 h后的细胞，用PBS清洗两次，收集细胞加入预冷75%乙醇固定，再用PBS洗去固定液，然后加入RNA酶反应4 ℃过夜，与碘化丙啶(PI)染液混匀后，室温避光30 min，过200目筛网后流式细胞仪上机检测，激发波长480 nm，并用ModfitLT 2.0软件分析细胞周期和凋亡，计算各期细胞所占的比例及凋亡率。细胞凋亡率检测采用Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染处理。

2.5 Western bolt检测As2O3对NCI-H460细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、CDK1、c-Myc蛋白表达水平的影响：收集不同浓度As2O3处理NCI-H460 24 h的细胞，加入蛋白酶抑制剂PMSF和RIPA裂解缓冲液(PMSF∶RIPA=1∶100)提取细胞总蛋白，在冰上裂解30 min，12000 r/min，4 ℃，离心15 min取上清。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，并按比例加入5×蛋白上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min使蛋白变性。用SDS-PAGE凝胶分离蛋白，并将所需检测的蛋白转印至PVDF膜上，用5%牛奶室温下封闭1 h，随后分别将Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、CDK1、c-Myc(稀释比例均为1∶1000)兔单克隆抗体4 ℃孵育过夜，β-actin(1∶1000稀释)作为内参对照。1×TBST 10 min清洗膜3次，再用HRP-山羊抗兔二抗(1∶10000稀释)在室温下孵育1 h，1×TBST 10 min清洗膜3次。最后采用ECL化学发光液在暗室用胶片显影，蛋白条带用image-J软件定量分析。

结 果

1 As2O3抑制人肺癌NCI-H460细胞的增殖 采用CCK-8法检测As2O3不同浓度(0、2.5、5、10、15、20和25 μmol/ml)干预NCI-H460细胞24、48、72 h后的增殖抑制能力，随着药物浓度的增加，As2O3的抑制率逐渐升高，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.001,图1A)。并且As2O3的抑制率随着时间的变化而明显提升，说明As2O3能够有效抑制肺癌NCI-H460细胞的增殖，呈剂量—时间依赖性。As2O324、48、72 h作用NCI-H460细胞的IC50分别为(15.88±1.49)μmol/ml、(6.33±0.36)μmol/ml、(5.09±1.33)μmol/ml。

为了进一步验证As2O3对NCI-H460细胞增殖能力的影响，采用集落形成实验观察As2O3(5、10和15 μmol/ml)作用NCI-H460细胞24 h后的克隆形成率。在加药作用24 h后，随着药物浓度的增加，NCI-H460细胞的克隆形成率及大小均明显减弱。对照组和As2O3(5、10和15 μmol/ml)克隆形成率分别为：(56.67±5.1)%、(29.56±1.13)%、(17.36±1.42)%、(6.26±1.36)%；与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.001,图1B)。

注：与对照组比较，***P<0.001图1 CCK-8法(A)和集落形成实验(B)检测不同浓度As2O3对NCI-H460细胞增殖的影响

2 As2O3对NCI-H460细胞周期的影响 随着药物浓度的增加，对照组与As2O3(5、10和15 μmol/ml)组G0/G1期所占细胞比例逐渐减少，S期、G2/M期细胞数量增加，以G2/M期细胞数量增加更为明显。其中G2/M期所占细胞比例分别为(12.13±1.24)%、(14.33±1.12)%、(26.22±1.58)%、(31.83±2.76)%，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.001)；S期所占细胞比例无统计学意义差异(P>0.05,图2A)。说明As2O3作用NCI-H460的细胞周期阻滞主要发生在G2/M期，与药物浓度呈正相关。此外，随着As2O3浓度的增加，As2O3(10、15 μmol/ml)组下调CDK1、c-Myc表达；与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05、P<0.01,图2B)。

3 As2O3诱导NCI-H460细胞凋亡 对照组与As2O3(5、10、15 μmol/ml)组的细胞凋亡率分别为(14.13±0.77)%、(15.66±0.78)%、(30.4±0.45)%、(45.26±0.81)%。随着药物浓度的增加，NCI-H460细胞的凋亡率逐渐递增； 10、15 μmol/ml药物组与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.001，图3A)。当As2O3浓度为5、10、15 μmol/ml时可以下调Bcl-2蛋白表达(P<0.01)，上调Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达(P<0.05、P<0.01和P<0.001,图3B)。

讨 论

在肺癌中，As2O3的抗癌作用涉及抑制肿瘤干细胞样细胞、通过阻滞周期抑制增殖、诱导细胞凋亡、抗血管生成、化疗和放疗的增敏、低氧环境的抗癌作用，以及免疫调节作用[8]。我们在体外观察了As2O3对人肺癌细胞株NCI-H460细胞增殖的影响。结果发现As2O3显著抑制了NCI-H460细胞的增殖和生长，并且抑制作用随着药物浓度的增加、作用时间延长而明显增强，呈时间—浓度依赖性。

细胞周期调控失控是肺癌发生的主要原因之一。因此，诱导肿瘤细胞周期阻滞的药物成为肿瘤治疗中关注的焦点。研究表明As2O3可以通过诱导肿瘤细胞G2/M期阻滞作为一种有效的抗癌药物[9-10]。为了验证As2O3对NCI-H460细胞周期的影响，我们检测了经过As2O3干预NCI-H460细胞24 h后的细胞周期变化，发现As2O3对H460的细胞周期阻滞发生在G2/M期，与药物浓度呈正相关。并且我们还发现As2O3下调了CDK1、c-Myc蛋白表达，这可能与As2O3参与阻滞NCI-H460细胞周期有关。

有研究报道，As2O3通过下调Bcl-2蛋白表达并诱导G2/M细胞周期阻滞来诱导凋亡[11-12]。Bcl-2是已知重要的抗凋亡蛋白，可以通过线粒体凋亡途径发挥抗凋亡作用。通过诱导Bcl-2蛋白表达下调，促凋亡蛋白Bax表达上调，可导致线粒体外膜通透性(MOMP)增加、线粒体膜去极化(MMD)和细胞色素C释放，激活Caspase级联反应[11]。许多研究表明As2O3下调Bcl-2蛋白诱导肺癌细胞凋亡[9,13-14]，上调Bax促进癌细胞凋亡[13]，这和我们的研究结果一致。

此外，As2O3激活Caspase信号传导途径，降低线粒体膜电位并促进活性氧(ROS)的产生，导致细胞凋亡[12]。Caspase依赖的细胞凋亡可分为外源性死亡受体介导的凋亡途径和线粒体介导的内源性凋亡途径，其中Caspase-3是细胞凋亡的主要效应因子和关键的执行者，Caspase-9是细胞凋亡启动蛋白酶[15]。在本研究中我们观察到As2O3对NCI-H460细胞以剂量依赖的方式，通过下调Bcl-2、上调Bax蛋白表达，激活Caspase-9、Caspase-3促进了细胞凋亡。

因此，深入研究As2O3作为肺癌的候选药物具有重要意义。本研究揭示了As2O3能有效抑制人大细胞肺癌细胞株NCI-H460的增殖，并且可以阻滞细胞周期，诱导相关凋亡蛋白发挥其促凋亡的作用。这为我们今后进一步开展As2O3在肺癌中的研究提供了一定的理论与实验依据。