大麦青稞小孢子高频再生体系的建立及其在遗传育种上的应用研究

牛姣姣

摘   要：小孢子培养技术被广泛应用于十字花科类的作物育种中，并且已经取得不错的成果，但是在一些禾本科作物方面的应用并不大。一方面，小孢子培育技术的体系建立与实施难度大，另一方面，应用于研究与实践的材料基因受限。对大麦青稞小孢子高频再生体系的建立与体系优化进行了阐述，并通过实际的研究育种及其结果的获得，表明采用这种培养技术方式能够形成高效的单倍体株系，并经过研究团队的鉴定与品种和品类的试验，筛选出所需要的具有很强抗病、耐病、性状突出的大麦青稞植株，并且使得小孢子高频再生技术得到了改良，具有很大的市场应用价值与前景。

关键词：大麦青稞小孢子高频再生体系;建立;遗传育种;应用

大麦属于啤酒业的主要原料之一，也为畜牧养殖业提供了很多高质量的能量饲料，同时大麦本身具有很高的营养价值，是食品加工重要而丰富的原料。大麦对于国家经济发展和人类的健康生活有着重要的意义。青稞属于大麦的一种，有着非常高的食用价值，是青藏高原人们生存与繁衍的最重要食物之一，对于边远地区的发展也极其重要[1]。因此，大麦有着很高的市场需求，在其选育方面显得尤为重要。

1   大麦小孢子高频再生体系的建立

在大麦的新品种选育方面，要想提高选育的效率，只有通过提高育种技术实现。近几年较流行的小孢子培养技术是一种效率较高的单倍体育种手段，已经被应用到大麦、油菜、烟草等农作物上，只是这种技术手段在推广方面还是会受到一些限制[2]。为了使大麦青稞育种突破这种受限，本文采用了一种在大麦中创建小孢子高频再生体系的方式，在选取的优质育种材料中取出小孢子进行再生培养，与各地区的相关育种团队进行合作，培育优质的大麦与青稞的新品种或品系，甚至研究出大麦的遗传改良方法。

对于生产方面的大麦主栽品种与创建育种材料的小孢子高频再生体系，是实践小孢子技术的基础和前提[3]。通过对小孢子的离体培养再生，获得大量的加倍单倍体植株，并且建立更永久、稳定的植株体系才能满足需要，然后对植株分别采取全方位的处理方式，并对其每个步骤采取优化处理，从而针对我国的大麦品种系列建立特有的小孢子高频再生体系。

通过建立的这一个高频再生体系，从不同的大麦育种生态区中选择具有代表性的品系或者品种，并进行游离的小孢子培养研究。对于北方，本次研究所选择的是来自于黑龙江的垦啤麦7号和甘肃的甘啤6号;对于黄、淮地区，选择的是秋播大麦;对于江苏地区，选择的是苏啤3号;对于上海地区，选择的是花30作为对照。经过研究与试验后结果呈现出：在选择的这些品种与品类中，其小孢子再生植株最高频率是花30，达到1×105个/培养皿，也就是平均每培养皿小孢子为378.7株，其会比栽培其他品种的大麦（栽培品种为253株/1×105个小孢子），即花22小孢子的再生频率提高了很多;与国外所采用的具有很高花培再生频率的品种，如Igril类的品种而言也更胜一筹，其所采用的最高花培再生频率为每100个花药1 009.8株，其再生绿苗植株数目的比例为87.6%，根据每个花药达到3 000个获得的游离小孢子，它的再生频率为每1×105个小孢子的再生频率是295株。对于6号甘啤，每1×105个小孢子，其绿苗的再生频率是216.3株，这种小孢子再生频率的绿苗比很高。因此，通过数据对比可以发现，选育的4份育种材料小孢子的再生绿苗，单皿都在100株以上。除此之外，还有其他的一些白苗，因此，白苗比例不合理的问题是创建小孢子高频再生体系过程中所存在的问题之一，有待研究与解决。

针对于青藏地区的青稞作物，其小孢子在培养中存在迟钝基因型问题，还需要对其高频再生体系进行进一步的优化[4]。

2   大麦小孢子高频再生技术在育种中的具体应用

本研究是基于已经创建的小孢子高频再生技术之上，并且结合目前发展后的小孢子的各种培养和选择的方法上，例如高盐、低氮等培养新方法，为我国东北、内蒙古、青海等地区的大麦青稞进行了持续的小孢子培养，到2018年底已经实现600多份育种材料的培养，并且超过了12万株的再生植株。近5年左右的小孢子再生植株培育，实现了每年上万份的再生与培育，其育苗的成活率高于90%，植株再生结实率超过90%。参与实践的各大育种团队通过培育技术，获得小孢子的加倍单倍体株系后，立即投入试验中进行鉴定性试验与育品试验，从而获得了一系列的品种与品系优良的大麦青稞，大大提升了我国大麦青稞的区域育种效率。

基于大麦小孢子的高频再生技术，近几年我国还对另外3项的遗传方法进行了新改良，并且已经在其具体应用上取得一些效果。①获得专利号（201510890842.3）的不用经过种子进行培育的单株小孢子的培养技术方法。通过小孢子培育花30的高频再生大麦，一方面实现了高频再生的单株小孢子，另一方面实现了不用经过种子阶段进行培育的高频再生的植株小孢子，这一培育技术目前已经投入运用于大麦花30及西藏地区野生大麦的F1中进行的小孢子培养，解决了野生培育外源基因的栽种难题。②获得专利号（201611011357.5）的在小孢子高频再生体系的培育基础之上的转基因方法。通过农杆菌對小孢子进行直接性的侵染与游离培育，能够将其目标基因进行花30的转换，其转换效率达到了17%，比通过使用基因枪的方式对花药进行轰击方式的效率更高;通过CRISPR/Cas9基因，即在水平方向上对小孢子的靶向基因（白粉病广谱抗性基因）进行改编，以便提高大麦花30的基因编辑后的效率。③获得专利号（201410710796.X）的单倍体的培养方法。通过小孢子培育技术获得单倍体植株，通过诱导丛生芽的方式培育单倍体再生植株，持续进行培育至第5代以后经过检测仍保持单倍体的倍性，以此建立了稳定的具有单倍体无性繁殖特性的群体，从而解决了单倍体育种的难题，从当下单倍体植株中获得植物细胞中叶肉细胞的原生质体，并且对其转基因与基因进行编辑和研究。

3   结语

大麦青稞小孢子技术的发展与研究，使得单倍体植株具有了再生系统，比传统的花药培育方法更加有效。据一些研究报道发现，在大麦中对其小孢子进行培养与再生的绿苗，相比传统的采取花药的方式培育得更加高效，其效率提高了9.3倍，说明采用小孢子培育的方法能够使得培育后的绿苗比采用传统的花药培育在高频再生方面更具有发展的潜力。国内外对于小孢子的培育方面已经有不少培育的方法，但是要想使得小孢子的培养技术能够达到育种的目的，不仅需要在生产上进行大量的实践与研究，攻克其植株的基因障碍，还需要通过高频再生绿苗的方式得到所需要小孢子再生的植株。另外，这种培养技术还要用加倍单倍体的方式进行辅助。本文所研究与阐述的这套小孢子高频再生技术用在大麦青稞大量进行育种方面具有很好的效果，有利于促进我国大麦小孢子育种的进程，也提高了常规育种的效率，在市场上具有很大的应用价值。

本文对突破大麦小孢子育种方面的技术进行研究，创建了高频再生体系，经过单个培养皿对小孢子进行培养得到了上百株的再生植株，然后在此之上对单倍体细胞进行多种技术方式的诱变、筛选、基因编辑等，使得植株细胞的原生质体发生融合。通过小孢子培养的方式，在其中放进一些非生物胁迫处理，然后对其进行诱导或杂交，使得单倍体植株的耐盐、耐氮、抗病性等方面得到加强。

经过试验表明，采取这样的杂交、诱变等方式，能够使得小孢子育种技术具有很广的市场应用与发展价值。近年来，在小孢子培养方式之上发展出一些不用经过单株小孢子培养的方式，对单倍体群体或其材质进行编辑与转基因的方式，对植株细胞的原生质体培养等方式取得了很大的发展，并且处在不断的优化中。通过研究与实践这些培养方法使得大麦的基因遗传作用被应用在市场中，也为同类型谷类作物的遗传与基因改良提供了可参考的价值。

参考文献：

[ 1 ] 徐齐君，王玉林，原红军，等.青稞再生体系的建立及优良受体基因型筛选[J].大麦与谷类科学，2019，36（4）：1-10，38.

[ 2 ] 星晓蓉.油菜小孢子培养技术及其在遗传育种中的应用研究概况[J].青海农林科技，2011（3）：24-26.

[ 3 ] 危文波.農杆菌介导的青稞遗传转化体系构建的研究[D].西宁：青海大学，2015.

[ 4 ] 陈志伟，陆瑞菊，黄剑华.大麦空间诱变与小孢子培养复合育种技术及应用[J].上海农业学报，2012，28（4）：160.