预处理对果蝇唾腺染色体制片的影响

高汝勇

（衡水学院生命科学系 河北 衡水053000）

果蝇是经典遗传学实验的模式生物。果蝇3龄幼虫是观察唾腺染色体的优选材料[1]，果蝇唾腺染色体常染色质区的核蛋白纤维在分裂间期不断复制，但复制产物却不分开，结果成千上万条染色质纤维平行排列成一个长为2 mm、宽为5 um的宽大带状物，因此成为多线染色体[2]。唾腺染色体上的横纹具有特异性，染色体上发生的缺失、重复、易位等结构变异很容易在光学显微镜下通过横纹的位置和数目来判断。另外果蝇唾腺染色体也是观察染色体形态特征，研究其化学组成、基因表达调控，以及进行各类神经疾病研究等的很好材料[3]。果蝇唾腺染色体观察实验是遗传学的经典实验之一，该试验操作性很强，在学生制片过程中染色体往往聚成团，降低实验效果。本试验研究唾腺剖取前的一些试验步骤，旨在提高唾腺染色体的伸展效果，提高试验的成功率。

1 材料与方法

1.1 试验材料和用品。果蝇，改良品红、0.4%NaCl、0.75%NaCl、玉米粉、琼脂、酵母粉、白糖、丙酸。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的制备。玉米粉15 g、琼脂1.5 g、酵母1.4 g、水150 ml、白糖27 g、丙酸1.5 ml，制备5瓶培养基。

1.2.2 幼虫培养。在250 ml的培养基中接种10对左右成虫。大量幼虫出现后，在培养基表面撒少许酵母粉，把幼虫放在15℃～18℃的恒温箱中培养。

1.2.3 唾腺染色体标本制备。在大量3龄幼虫出现后，把幼虫培养基放置在3℃～5℃的冰箱中，分别低温处理12 h、24 h、36 h。挑选3龄幼虫中已爬上瓶壁、行动迟缓、长约5 mm、半透明或者有些发黄但未化蛹的肥大幼虫。剖取腺体、解离、水洗、改良品红染色、压片，显微镜下观察、拍照。

2 结果与分析

2.1 肥大幼虫的培养。按照如上配方，减少了5 g玉米粉的用量，制成的培养基比较松软，发酵良好，非常适合果蝇幼虫生长。大量低龄幼虫出现后向培养瓶中加入的酵母粉可作为幼虫的补充营养。把幼虫放在15℃～18℃的恒温箱中培养，能改变果蝇的生活周期，延长幼虫阶段的时间，能使幼虫变得肥大，唾腺也相应增大，这样有利于学生在解剖镜下识别唾腺、剖取唾腺。

2.2 低温处理效果分析

2.2.1 传统实验方法弊端。获得合适3龄幼虫后，传统的实验方法都是先剖出唾腺，然后直接用盐酸进行解离，这种方法在后期制片时唾腺染色体不容易分散，必须费力用橡皮头敲击盖片以利于染色体分散。但是学生在进行实验时往往不好掌握敲击的力度和时间，力度小、时间短没有效果；力度过大、时间过长唾腺染色体又容易发生断裂。

2.2.2 低温处理后效果。3龄幼虫经过低温处理后可以改善唾腺染色体的伸展效果。本实验在有大量3龄幼虫出现后，把幼虫培养基放置在3℃～5℃的冰箱中分别低温处理12 h、24 h、36 h。之后按照常规方法剖取唾腺、盐酸解离、水洗、染色、获得制片，比较低温处理在剖取唾腺染色体难易程度、脂肪剔除的难易程度以及染色体伸展程度上的区别，最终结果如表1。

表1低温处理时间及其效果

根据表1我们可以看出，低温处理12 h的3龄幼虫最易剖取唾腺。低温处理24 h之后，3龄幼虫身体弹性降低，在剖取唾腺过程中身体容易断裂，所以相比于低温12 h的幼虫较难剖取唾腺。低温处理36 h的3龄幼虫，身体已经完全没有了弹性，经常一拉就断，内容物流出，学生往往找不到食道，更不容易找到食道前端两侧的一对唾腺。在剔除脂肪的难易程度上可以发现，经过低温处理的幼虫比未经处理的幼虫好剔除脂肪，并且随着低温时间的延长，脂肪量越少，处理36 h的幼虫几乎没有脂肪，或者有很少量的脂肪，也容易用解剖针剔除。在染色体伸展效果上，低温处理24 h的效果最好(如图1)，其次是12 h的(如图2)，36 h的效果最差(如图3)。

图1低温处理24 h

图2低温处理12 h

图3低温处理36 h

图4分散良好的唾腺染色体

2.3 解剖前低渗预处理。研究对比了在0.75% NaCl中直接剥取唾腺，在蒸馏水和0.4% NaCl分别低渗30 min、在0.75%NaCl中等渗30 min后再剥取的实验，以便区分常规直接解剖与低渗处理后解剖在拉取唾腺、剔除脂肪的难易程度上的区别。

2.3.1 蒸馏水低渗30 min。在蒸馏水中低渗30 min后的幼虫，由于吸水明显变大很多，同样唾腺染色体细胞也由于吸水变大，所以在解剖过程中唾液腺腺体很容易找到，并且脂肪都是聚集在一起的，一拉便可完全剔除。

2.3.2 0.4% NaCl低渗30 min。在0.4% NaCl中低渗30 min后的幼虫及其唾液腺腺体虽然也会吸水膨胀，但没有在蒸馏水中膨胀的大，因此在解剖的难易程度上，相比于蒸馏水处理过的稍微逊色一些，但仍是好剖取的。在染色体伸展状况上，0.4%NaCl处理要比蒸馏水处理要好，伸展得更充分。

2.3.3 0.75% NaCl中等渗处理30 min再剖取唾腺和0.75%NaCl中直接剖取唾腺。在0.75% NaCl中等渗处理30 min后再剖取唾腺和在0.75%NaCl中直接剖取唾腺时，幼虫头部较小，不容易拉伸，唾腺也小，不容易寻找，并且脂肪分布杂乱，不容易剔除，效果较差。

3 结论与讨论

多饲酵母粉和15℃～18℃条件下培养果蝇幼虫，利于幼虫的生长发育，可增加唾腺腺体体积，利于唾腺的识别和剖取。

将3龄幼虫置于3℃～5℃低温下处理24 h，利于唾腺剖取、脂肪体的剥离、染色体的伸展。在解剖果蝇之前，若用低渗溶液处理，细胞会吸水膨胀变大，有利于拉取唾腺和识别腺体，并且在压片时，染色体能更好的分散[4]。本实验发现，把低温处理24 h后的3龄幼虫在0.4% NaCl中低渗30 min，这样制得的染色体制片成功率明显比常规方法高很多(图4)。这些在剖取唾腺之前的预处理步骤会大大提高实验的成功率，解决常规方法中学生经常遇到的不好剖唾腺、不易找到腺体、染色体伸展不充分、细胞重叠等问题。