犬瘟热病毒一步法RT-PCR 检测方法的建立与应用

李文佳，陈 姗，高 旭

延边大学动物医学系，吉林延吉 133400

犬瘟热（canine distemper，CDV）是由犬瘟热病毒（canine distemper virus， CDV)引起犬科动物的一种高度接触性、烈性传染病，我国将其列为二类动物传染病，一年四季均可发生，尤其是季节交替和高温天气更容易发病[1]。主要临诊症状是反复发热和后期的神精症状，伴有腹泻和呕吐，由于病程晚期病毒损伤患犬神经元，多为死亡或预后不良，患病幼犬死亡率高达80%。CDV 无论在病情严重程度、传染强度，还是在死亡率上都是犬类动物传染病之首，给养犬业带来巨大重创[2]。

CDV 为负链单股RNA 病毒，属于副粘病毒科，副粘病毒属成员。由于与同属的牛瘟病毒（RPV）和麻疹病毒（MV）存在抗原相关性，临床诊断中血清学方法常存在争议[3]。因此，分子诊断较为可信，在众多分子诊断方法中，RT-PCR 方法应用较多，但由于常规的RT-PCR 检测方法需要两步进行，即在进行PCR 之前，需要经历病毒基因组RNA到cDNA 的反转录，往往在反转录过程引入污染源，导致假阳性出现。而一步法RT-PCR 检测方法避免了中间环节，反应可以在一个反应管中一步完成，不但节省时间，还可大大提升检测准确率[4]。因此，本研究拟参照GenBank 已登录的CDV 基因序列，选取核蛋白编码基因N 作为目的基因，设计一对特异性引物，建立一种特异、高效、灵敏、重复性好的CDV 一步法RT-PCR 检测方法，为CDV 感染的早期诊断和病原体监测提供一种有效的检测方法。

1 材料与方法

1.1 毒株与病料

犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）和鹅细小病毒（GPV）由延边大学预防兽医学实验室分离保守；狂犬病病毒（RABV）活疫苗由齐鲁动物保健品有限公司生产。36 份疑似CDV 感染的肛门拭子采自延边地区多家动物医院。

1.2 试剂

质粒提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒、DL2000 DNA Marker 和一步法RT-PCR 检测试剂盒购自TaKaRa 公司；病毒基因组RNA/DNA 提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 引物的设计与合成

根据GenBank 已登录的CDV 基因序列（JN381190）， 利 用oligo 6.0 软 件 在CDV的核蛋白编码基因N 保守区内设计一对特异性引物， 上下游引物分别为CDV-F:5`-CAAGCATTGTTACAAGGTCTCGACT-3`;CDV-R:5`-GATGCTTGGGATTACCTCTACTAAC-3`，引物由潍捷基（上海）生物技术有限公司测序合成。

1.4 病毒基因组RNA 的提取

应用病毒基因组RNA/DNA 提取试剂盒，取200μL 的CDV 的Vero 细胞培养液，反复冻融，按照说明书，进行CDV 基因组RNA 的提取和纯化。

1.5 一步法RT-PCR 反应条件优化

依据设计引物时推荐的相关参数，采取梯度法和方阵法对进行优化试验，反应体系为25 µL，用1%琼脂糖凝胶电泳进行观察。

1.6 扩增产物的TA 克隆、酶切与测序

应用DNA 凝胶回收试剂盒将目的基因进行回收与纯化，通过TA 克隆将目的基因连接到pMD18-T载体，经DH5α 感受态细胞转化、涂板和摇菌，将菌液PCR 鉴定为阳性的质粒送英潍捷基（上海）生物技术有限公司测序。

1.7 特异性试验

取犬瘟热病毒（CDV）、狂犬病病毒（RABV）的基因组RNA，以及犬细小病毒（CPV）和鹅细小病毒（GPV）的基因组DNA，以最优条件进行一步法RT-PCR 检测。

1.8 敏感性试验

应用分光光度计对CDV 基因组RNA 进行定量，然后进行倍比稀释，RNA 含量分别为10 µg、1 µg、0.1 µg、10 ng、1 ng 和0.1 ng，以最优条件进行一步法RT-PCR 检测。

1.9 重复性试验

以CDV 基因组RNA 为模板，进行批间和批内重复试验，并设立阴性对照，计算变异系数。

1.10 临床应用

取36 份犬肛门拭子送检样本，进行一步法RT-PCR 检测法检测，检测结果送往测序公司测序，对结果进行准确认定。

2 结果

2.1 扩增产物的检测与鉴定

经1%凝胶电泳检测后，在约200 bp 处出现特异条带，与预期结果相符（图1）。将目的基因TA克隆获得质粒命名为pMD18-CDV-N-197，经测序鉴定为CDV 的N 基因。

图1 基因扩增结果

2.2 一步法RT-PCR 反应体系与反应条件

经方阵法和梯度法，确定最终的反应体系为：2×one-step buffer 12.5 µL，one-step Enzyme Mix 1 µL，RNA 模板4 µL，CDV-F 与CDV-R 引物各1 µL，加水补齐至25 µL；最优反应程序为：50 ℃30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72℃ 20 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min。

2.3 特异性试验结果

应用建立的一步法 RT-PCR 检测方法，对CDV模板可扩增出长度约为197bp 的目的基因，而对狂犬病病毒（RABV）、犬细小病毒（CPV）和鹅细小病毒（GPV）和水空白对照均未见扩增（图2）。

图2 特异性试验结果

2.4 敏感性试验结果

取6 µL 倍比稀释的一步法RT-PCR 扩增产物，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果表明，已建立方法最低能检测到1 ng 的CDV 基因组RNA（图3）。

图3 敏感性试验结果

2.5 重复性试验结果

结果显示，批间与批内试验的变异系数均小于2%，说明本研究建立CDV 一步法 RT-PCR 检测法具有较好的重复性。

2.6 临床检测结果

应用已建立的一步法RT-PCR 方法，对采自延边地区多家动物医院36 份疑似CDV 感染的肛门拭子进行检测。检出阳性样本4 个，并且4 份测序结果均为阳性，阳性率为11.11%。

3 讨论

延边朝鲜族自治州是朝鲜族的聚集地，由于朝鲜族喜欢食用狗肉的饮食文化特点，使养犬业在延边地区比较普遍和盛行，加之和朝鲜、俄罗斯比邻，与日本海相望的地域特点，使延边地区犬瘟热病毒的流行具有自身特征和变数。目前，犬瘟热病毒呈世界范围分布，最早于1905 年，由Carre 发现并提出该病病原体是一种病毒。经随后近50 年的研究，于1951 年Dedie 首次通过组织培养方法分离到CDV[1]。我国最早暴发犬瘟热（CD）于1968 年，此后由华北地区蔓延至全国，现在CDV 感染已是犬及幼犬死亡的主要传染病，其次是感染犬细小病毒（CPV）[3，5]。临床上未免疫犬一旦感染CDV，几乎死亡率达80%左右，给养犬业带来了巨大损失，严重威胁着宠物犬的生命，建立一种能够为CDV 感染提供早期准确分子诊断方法是控制CD发生的关键。

本研究建立的一步法RT-PCR 检测方法，采用了PrimeScript 反转录酶和DNA 聚合酶不仅50 ℃较低退火温度下抑制非特异性扩增，还提高了RTPCR 扩增效率，其敏感性也高达1ng 基因组RNA，比常规RT-PCR 敏感性高。通过临床实践应用，对采自延边地区多家动物医院36 份疑似CDV 感染的肛门拭子进行检测，阳性率为11.11%，提示延边地区CDV 感染率较高，应该采取有效的免疫措施，控制CDV 的传播与蔓延。因此，本研究建立的CDV一步法RT-PCR 检测方法敏感性高，特异性和重复性好，可用于CDV 的临床诊断和病原监测。