基于氢氧稳定同位素的桃果原汁掺水鉴别

蒋 越 李 安 靳欣欣 潘立刚 张志勇

(1. 北京农学院食品科学与工程学院, 北京 102206; 2. 北京农业质量标准与检测技术研究中心, 北京 100097)

中国作为世界上水果第一生产大国，其果汁类饮品因方便饮用、便于携带、营养价值高等诸多优势[1]备受消费者青睐，且在软饮料行业中也占有越来越重要的地位[2]。随着近年来果汁产量的不断增长，且果汁在生产加工过程中所需原料成本较高，一些不法企业常借以各种掺杂手段以达到降低成本的目的[3-4]，一定程度上阻碍了食品市场的稳定发展[5-7]。

水果原汁掺水是影响产品顺利出口和国际声誉的主要问题之一。针对果汁市场上出现的掺假现象及多变的造假技术，越来越多的国内外学者展开了相关研究，并提出了一系列的鉴别方法。目前，果汁掺水检测可利用折光计检测样品的可溶性固形物、果汁的缓冲能力[8]、缓冲容量[9-10]及单体氧同位素[11-13]加以鉴别。而利用单体氧同位素进行果汁掺水鉴别时，存在一定局限性，往往会因同位素发生分馏使其准确性降低。试验拟以天然桃汁中水分的氢氧同位素组成为参照对象，利用全自动真空冷凝抽提技术—元素分析仪—稳定同位素质谱仪法，使样品在提水过程中同位素不发生分馏效应，综合比较不同掺水比例下果汁中H、O两种同位素组成同天然果汁中水分氢氧同位素组成的差异，并建立掺水鉴别方法，以弥补利用单体氧同位素鉴别方法的不足，旨在为建立桃汁掺水鉴别方法，建立食品安全可追溯体系[14]，推动稳定同位素技术在水果及其制品掺伪鉴别领域的深入研究和实际应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

VSMOW2(δ2H=0‰，δ18O=0‰)、USGS45(δ2H VSMOW=-10.32‰，δ18O VSMOW=-2.238‰)、USGS47(δ2H VSMOW=-150.2‰，δ18O VSMOW=-19.80‰)：美国地质勘探局Reston稳定同位素实验室；

GB04459(δ2H=-63.4‰，δ18O=-8.61‰)、GB04460(δ2H=-144‰，δ18O=-19.13‰)：中国地质科学院水文地质环境地质研究所；

稳定同位素比值质谱仪：MAT253型，美国赛默飞世尔公司；

元素分析仪：Flash 2000HT型，美国赛默飞世尔公司；

榨汁机：HR1832型，飞利浦(中国)投资有限公司；

旋涡混匀器：IKA VORTEX 4 Digital型，莱贝(上海)科技仪器有限公司；

真空冷冻干燥机：SCIENTZ-18N型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

全自动真空冷凝抽提仪：LI-2000型，北京理加联合科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集 2019年7～8月于桃子成熟期前往北京市平谷区采摘同一品种的大桃样品若干，具体选果要求：成熟度一致、着色较好的果实；单果质量相近；出汁率不低于75%；可溶性固形物含量为11%～15%。外源水样：北京地区地下水，于2019年8月1日取自北京市平谷区。

1.2.2 样品预处理 干布擦拭干净样品表面，去除果核及果柄，切块，榨汁，将果渣与果汁分离，收集桃汁样品装盒后封口膜封口，于-25 ℃冷冻保藏。

1.2.3 桃汁掺水方案 以水分提取的桃汁样品为掺伪对象，将已知氢氧同位素丰度比的外源地下水样与桃汁样品以不同比例添加至10 mL具塞离心管中，其中混合样品的掺水比例依次为0%，5%，10%，20%，40%，80%，100%，涡旋混匀。

1.2.4 果汁水分提取 准确称取1 g桃汁样品装入玻璃样品瓶中，顶部塞满脱脂棉以防止水果残渣暴沸污染管路，利用自动水分真空抽提仪对桃汁样品中的水分进行提取。提取时间2 h，提取温度100 ℃，样品收集冷阱温度-90 ℃。待收集水分解冻后，过0.45 μm微孔滤膜并转入进样小瓶中，上机待测。

1.2.5 果汁水分提取方法评价 将桃汁样品在真空冷冻干燥机中冻干48 h，分别加入与失水重量相等的标准水样USGS45、GB04459、GB04460，搅匀，按1.2.4方法提取水样并进行氢氧稳定同位素测定与分析评价。

1.3 氢氧稳定同位素分析及数据表达

将提取的样品水分置于元素分析仪的自动进样盘中，样品于1 380 ℃下在玻璃碳珠催化作用下裂解为H2和CO，即样品中的H和O元素转化成H2和CO气体，在氦载气流和色谱柱吸附解吸后，H2和CO先后进入稳定同位素质谱仪进行同位素比值的测定。以VSMOW2、USGS45和USGS47为标准物质，采用3点校正的方式对测试结果进行校正[15]。元素分析—稳定同位素质谱仪(EA-IRMS)参数为：氦气载气流速100 mL/min；H、O裂解炉温度1 380 ℃；分子筛色谱柱温度60 ℃。采用相对测量法表达样品同位素的组成，即将待测样品中的同位素比值与标准物质的同位素比值进行比较，其结果称为样品的δ值，并按式(1)进行计算。氢氧同位素相对丰度比值均以平均海洋水的丰度为参照。

(1)

式中：

δhE——元素E的稳定同位素比率；

R样品——样品中元素E的稳定同位素相对丰度比；

R标准——标准参考物质中元素E的稳定同位素相对丰度比[16]。

1.4 数据处理

使用Excel 2007软件整理各项结果，并采用Origin软件作图，采用SPSS 16.0软件进行均值的差异显著性及单因素方差分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 氢氧同位素同时测定方法评价

由表1可知，添加USGS45样品中δ2H为(-11.10±1.39)‰，δ18O为(-2.38±0.53)‰；添加GB04459样品中δ2H为(-62.50±0.59)‰，δ18O为(-7.95±0.41)‰；添加GB04460样品中δ2H为(-142.00±3.40)‰，δ18O为(-20.26±2.14)‰，且P(δ2H)>0.05，P(δ18O)>0.05，说明利用此方法进行水分抽提的过程中样品的δ2H与δ18O 无显著性差异，即此过程中并未发生氢氧同位素的分馏效应，故利用此方法可有效提取桃汁中的水分。

表1 真空水分提取-EA-IRMS方法评价

2.2 基于氢氧同位素分析的鲜榨桃汁掺水鉴别

2.2.1 果汁掺水后的氢氧稳定同位素变化 研究[17]表明，北京地区大气降水中δ2H和δ18O的平均值在7～9月份内呈温度效应，δ2H和δ18O呈上升趋势，且与地下水氢氧同位素较为接近。地下水来源于降水，在地下水形成过程(淋溶、径流等)中总体上要比降水贫化。果树的水源主要来源于大气降水和地下水灌溉[18]，而水果中的水在果树蒸腾、土壤水蒸发等共同作用下，导致果实吸收利用的水比地下水要富集。由图1可知，当桃汁样品中未加入外源水时，即在0%处鲜榨桃汁提取的水分中δ2H 为-44.55‰，δ18O为-4.70‰，地下水样的δ2H为-64.65‰，δ18O为-9.14‰。随着外源地下水样占比的不断增加，鲜榨桃汁中掺杂外源地下水后H、O同位素均呈明显的重同位素贫化趋势，且相关系数均>95%，三者之间呈良好的负相关性。

图1 外源地下水样对鲜榨桃汁氢氧同位素组成的影响

2.2.2 外源水样的氢氧同位素多重比较分析 由表2可知，当地下水样占待测样品总比重≥10%时，δ2H差异显著性概率依次为0.032 9，0.001 4，0.000 2，0.000 4，0.000 9；当地下水样占待测样品总比重≥20%时，δ18O的显著性概率分别为0.012 5，0.000 2，0.000 4，0.000 5，说明当掺水比>20%时，P(δ18O)<0.05，此时掺水与未掺水桃汁存在显著性差异，可利用单体O同位素准确鉴别鲜榨桃汁的真实性；而鲜榨桃汁掺水后，H同位素较O同位素变化更灵敏，当掺入外源地下水>10%时，掺水果汁与同鲜榨桃汁两者的H同位素存在显著性差异，即可检出掺水，因此，可利用H同位素进行更少量的桃汁掺水鉴别。

表2 掺不同比例地下水下氢氧同位素多重比较†

2.2.3 基于H、O同位素桃汁掺水综合鉴别 参照李涛等[19]的方法表达基于以H、O同位素两项指标协同检测桃汁在掺水过程中H、O同位素组成的变化关系。若其中的一项或两项指标同鲜榨桃汁的有显著性差异即可鉴别为阳性样本，两项均与鲜榨桃汁的无显著性差异，则为阴性样本。由表3可知，当地下水样占待测样品总比重为5%时，P(δ2H)>0.05，无显著性差异，记作阴性样品；当地下水样占待测样品总比重≥10%时，δ2H差异显著性概率值P<0.05，即此时存在显著性差异，记作阳性样本；而当地下水样占待测样品总比重为5%，10%时，δ18O差异显著性概率值P>0.05，记作阴性样品；当地下水样占待测样品总比重≥20%时，δ18O显著性概率P<0.05，较鲜榨桃汁相比存在显著性差异，记作阳性样本。综合鉴定后表明：当鲜榨桃汁中掺加外源地下水样，且地下水占比≥10%时，可利用H、O同位素协同鉴定实现对桃汁的掺水鉴别，与牛丽影等[20]、高敏[21]的方法相比，此方法具有无分馏、回收率高等优势。

表3 氢氧同位素综合鉴别结果†

3 结论

通过已知氢氧同位素比值水样添加试验证实了氢氧同位素协同鉴定方法在果汁水分提取过程中分馏效应不显著，但方法具有可靠性；当地下水占比≥10%时便可实现桃汁掺水的鉴别，弥补了利用单体氧同位素进行果汁掺水鉴别的不足，但围绕稳定同位素技术的应用原理、关键溯源因子及其影响因素等问题还有待深入研究。随着掺假手段的层出不穷，应积极发展应用前景广泛的新兴技术，如稳定同位素技术等，通过多仪器、多方法、多元素连用的手段大力开发检测技术[22]，通过实践来改进方法，提高检测的可靠性。