卵巢癌组织中PD-L1及PD-L2的表达及其预后判断价值

袁风玲 贾淑慧 江 源

卵巢癌是一种常见的妇科肿瘤，美国癌症协会统计，其发病率仅次于子宫癌及子宫颈癌，位于第3位，但其死亡率却居妇科肿瘤的第1位[1]。随着医学临床技术的不断发展，外科及化疗已明显改善了卵巢癌患者的预后，但其总体5年生存率仍仅有45%，其中晚期卵巢癌患者的5年生存率只有30%，而早期卵巢患者的5年生存率在70%～90%。因此对卵巢癌患者进行早期诊断及治疗，有助于改善患者的预后[2]。近年来，免疫治疗已成为一种新的治疗方法，卵巢癌免疫逃逸机制与患者预后具有一定的相关性，其中T细胞活化不仅需要TCR-MHC抗原肽复合物提供第一信号，还需协同刺激分子提供的第二信号，而协同刺激分子通过以上信号对T细胞活化、增殖、免疫应答生物学功能进行调节，是治疗肿瘤的主要靶点之一[3]。在免疫治疗中关于程序性死亡因子受体及其配体(PD-1/PD-L1)的药物对多种肿瘤具有较好疗效，而PD-1是CD28/CTLA-4的家族成员，其配体有PD-L1及PD-L2，目前PD-L1及PD-L2的表达与卵巢癌的相关研究较少[4]，因此本文分析了卵巢癌组织中PD-L1及PD-L2的表达，并判断了其对卵巢癌预后的预测价值，以为卵巢癌早期诊断选择合适的诊断指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院2012年1月至2014年12月收治的58例卵巢癌石蜡包埋的组织标本，癌组织均取自肿瘤的原发灶，随访资料完整；排除术前行化疗、放疗者。患者年龄27～72岁，平均年龄为(55.1±4.5)岁，其中非浆液性囊腺癌者21例、浆液性囊腺癌者37例，肿瘤体积为3～5200 cm3，平均肿瘤体积为(1025.8±256.7) cm3，其中细胞分级低分化者35例、中高分化者23例，FIGO分期中Ⅰ期+Ⅱ期者13例、Ⅲ期+Ⅳ期者45例；发生转移者56例。取同期行卵巢囊肿手术的组织标本45例作为良性对照组，其患者年龄为26～71岁，平均年龄为(54.1±5.2)岁。2组患者的年龄等资料对比无统计学意义(P>0.05)。所有患者均用电话、门诊等方式进行随访，生存期为从手术日期至患者死亡的日期。

1.2 方法

2组均用Elivision TM免疫组化方法进行染色，先将石蜡切片置于烘箱中2 h，脱蜡至水，再用Ph7.4的PBS溶液冲洗3次，每次冲洗时间为3 min，取一定量的EDTA缓冲液置入微波盒中，加热至沸腾后将脱蜡水化的组织切片置于耐高温的切片架上，之后置入沸腾的缓冲液中处理10 min，再将微波盒取出，用流水进行自然冷却，之后取出玻片，用蒸馏水进行冲洗，再用PBS液进行冲洗，每张切片上滴上1滴3%的H2O2，于室温下进行孵育，切断内源性氧化物酶活动，之后再用PBS液冲洗，除去PBS液后每张切片滴加1滴PD-L1鼠抗人单克隆抗体及PD-L2鼠抗人单克隆抗体，稀释比例为1∶800，在4 ℃下孵育，再用PBS液冲洗，去除PBS液，于每张切片加一滴聚合物增强剂，于室温下进行孵育，用PBS液冲洗且去除PBS液后，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物，孵育30 min后用PBS液冲洗，再去除PBS液后加1滴新鲜二氨基联苯胺，于显微镜下进行观察，之后用苏木精进行复染，再用中性树胶进行封固、晾干；实验以PBS替代一抗作为阴性对照，之后让2名病理科医师进行读片。

1.3 观察指标及判断标准

(1)对比PD-L1、PD-L2在卵巢癌及卵巢囊肿组织中的表达；(2)分析卵巢癌组织中PD-L1与PD-L2蛋白表达与卵巢癌病理参数的关系；(3)用Kaplan-Meier法分析卵巢癌组织中PD-L1与PD-L2与患者术后总生存期的关系。

PD-L1与PD-L2阳性的判断标准：PD-L1、PD-L2阳性结果用Fromowitz半定量分级对细胞阳性比例及染色强度计分进行判定，其中阳性细胞>80%为4分，>50%～80%为3分，>25%～50%为2分，10%～25%为1分；细胞染色强度中棕褐色为3分，棕黄色为2分，淡黄色为1分，无着色为0分；其中二者总分之和6～7分为+++，2～5分为+～++，0～1分为-；其中+～+++为阳性，-为阴性[3]。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 对比PD-L1、PD-L2在卵巢癌与卵巢囊肿组织中的表达

卵巢癌组织中PD-L1、PD-L2阳性表达率明显高于卵巢囊肿(P<0.05)，见表1。

表1 对比PD-L1、PD-L2在卵巢癌与卵巢囊肿组织中的表达(例，%)

2.2 卵巢癌组织中PD-L1、PD-L2蛋白表达与卵巢癌临床病理参数的相关性

PD-L1、PD-L2在卵巢癌组织中的表达与患者的年龄、FIGO分期有明显相关性(P<0.05)，而与患者的细胞分级、肿瘤大小、肿瘤转移不相关(P>0.05)，见表2。

2.3 卵巢癌组织中PD-L1、PD-L2表达与患者术后总生存期的关系

采用Kaplan-Meier法分析发现，卵巢癌患者PD-L1及PD-L2阴性表达患者的总生存期明显高于阳性表达患者(P<0.05)，见表3。

表2 卵巢癌组织中PD-L1、PD-L2蛋白表达与卵巢癌临床病理参数的相关性/例

表3 卵巢癌组织中PD-L1、PD-L2与患者术后总生存期月)

3 讨论

卵巢癌的临床病理类型较为复杂，包括卵巢黏液性囊腺癌、卵巢浆液性囊腺癌、透明细胞癌、卵巢子宫内膜样癌、未分化癌等[4]，因其位置较深，因此患者在早期无明显症状，多不能检查确诊，随着疾病进展，待患者出现明显症状检查时已处于晚期，其中手术及术后辅以紫杉醇、顺铂联合化疗是常规的治疗方案[5]，但化疗容易产生耐药性，采用手术方式不能完全根治，因此改善卵巢癌患者预后的关键在于提高卵巢癌患者的早期检出率[6]，因此临床上需研发灵敏度更高、特异性更高的基因与分子靶向诊断指标。免疫治疗是控制、杀伤肿瘤细胞的一种新治疗方案，协同刺激分子可对T细胞的活化、增殖、免疫应答等生物学功能进行调节，是肿瘤治疗的一个主要靶点[7]。肿瘤细胞中的PD-L1、PD-L2信号通路已成为恶性肿瘤治疗的研究重点，因此本文分析了卵巢癌组织中PD-L1及PD-L2的表达对卵巢癌预后的判断价值。

本文结果表明，PD-L1与PD-L2在对照组卵巢囊肿组织中均为阴性表达，PD-L1与PD-L2在卵巢癌组织中阳性表达率分别为48.3%与39.7%。卵巢癌组织中PD-L1、PD-L2阳性率明显高于卵巢囊肿，PD-L1、PD-L2在卵巢癌组织中的表达与患者的年龄、FIGO分期有明显相关性，而与患者的细胞分级、肿瘤大小、肿瘤转移不相关。采用Kaplan-Meier法分析发现，卵巢癌患者PD-L1及PD-L2阴性表达患者的总生存期明显高于阳性表达患者；表明PD-L1、PD-L2阳性表达与卵巢癌患者的生存期密切相关，主要是由于PD-L1多表达于活化的B细胞、T细胞、巨噬细胞表面上[8]，其与PD-1结合可促使免疫逃逸，其阳性的肿瘤细胞与PD-1阳性T细胞结合后，可对T细胞增殖、分化进行抑制，并诱导其凋亡、耗竭细胞能量，其对一些恶性肿瘤有一定的抗肿瘤效应[9]。同时PD-L2受体是CD28家族的PD-1，其胞外区与PD-1的IgV样进行区域性结合，其结构中的酪氨酸会发生磷酸化，募集蛋白酪氨酸磷酸酶-1，从其下游的Zeta链相关蛋白进行去磷酸化，对PI3K/Akt激酶活性进行下调，从而使得p56lck失活，避免其向T细胞内传递免疫抑制信号，对激活T细胞进行抑制[10-11]，从而刺激免疫抑制性细胞因子IL-10分泌，其异常会对T细胞功能进行抑制，进一步对T细胞凋亡进行诱导，从而对抗肿瘤免疫反应产生影响，发挥免疫调节作用，因此PD-L1与PD-L2表达在卵巢癌与卵巢囊肿患者中会出现差异，也可用于卵巢癌预后的判断[12-13]。

综上所述，PD-L1及PD-L2可能参与卵巢癌的发生、发展，可用于卵巢癌的诊断及预后分析，肿瘤细胞与肿瘤微环境的关系有待进一步深度分析，从而更透彻地认识PD-L1、PD-L2信号通路，为卵巢癌的诊断、治疗提供新的思路。