微小RNA-382-5p (miR-382-5p)对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响及作用机制

乔 柏 岳亚敏 宋美楠

乳腺癌是临床常见的恶性肿瘤，99%为女性患病，其发生率呈逐年上升的趋势。对于乳腺癌的治疗，目前仍然是以手术为主要治疗方法，辅助以放疗和化疗，但是部分患者预后不佳，5年生存率较低[1]。乳腺癌的致病机制尚未完全明确，但是研究认为微小RNA(miRNA)在人体恶性肿瘤的发病中起到重要的作用[2]。MiR-382-5p被发现在乳腺癌中呈现低表达状态，为了观察其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响，我院进行了本次研究，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 患者选择

选择2018年1月至2018年12月至我院诊断为乳腺癌并的患者86例，所有患者均为女性，年龄31～77岁，平均年龄(47.82±10.33)岁；术后病理诊断浸润性导管癌65例，原位癌11例，粘液癌7例，其他浸润癌3例。本次研究报请医院伦理委员会并予以批准。

纳入标准[3]：①经术后病理检查确定诊断。②术前未进行过放疗、化疗的患者。③乳腺为原发病灶的患者。④患者对本次研究知情同意。

排除标准[4]：①未取得术中病理的患者。②乳腺部位的恶性肿瘤为转移病灶的患者。③术前进行过放化疗治疗的患者。④病例资料不完善的患者。⑤不同意参与本次研究的患者。

1.2 方法

1.2.1 取材 取患者乳腺癌组织0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm为观察组，同时取与乳腺癌病灶间隔5 cm以上同样大小的正常组织为对照组。标本常规甲醛固定。

1.2.2 设备及试剂 产妇在进行剖宫产手术后，将取出的胎盘进行收集，选择两块胎盘面积组织，重量为3 g，进行剪膜和漂洗，将一块胎盘放在温度在-80 ℃环境中，准备收集蛋白和RNA，将其余一块胎盘制作成长1.5 cm、宽2 cm，高3 cm的组织，并放入10%的中性甲醛溶液中，8到24 h后取出，制作成蜡块，存放于温度在-20 ℃中的环境中，行RT-PCR、Western blot。

1.2.3 细胞培养和转染 使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基对MCR-10A、MDA-MB-231以及HEK293细胞进行培养，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37 ℃、5%CO2以及饱和湿度的培养箱对BT-549、MCR-7细胞进行培养。选择对数生长期细胞作为转染对象，对照组转染miR-NC，观察组转染miR-382-5p，严格按照试剂盒要求进行操作。

1.2.4 PT-PRC检测 设备和试剂：Trizol购自美国Gibco BRL公司，Taq酶购自大连宝生物公司，模板RNA2 μg、M-MLV逆转录酶购自美国Promega公司。引物由上海生工生物工程公司合成。UVIpro凝胶图像分析系统购自美国KODAK公司。

方法：将标本通过Trizol方法提取组织总RNA，反应条件为95 ℃预变性5 min，94 ℃ 1 min，68 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共计29个循环，72 ℃延伸10 min。PCR反应产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳60 min，使用UVIpro凝胶图像分析系统进行摄像、扫描、分析。

1.2.5 Western blot法检测蛋白表达 取30 μg蛋白，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转至聚偏乙酰膜，在5%脱脂牛奶室温条件下封闭2h，配置一抗NF90抗体、GAPDH抗体1∶10000,4 ℃下孵育过滤，缓冲液洗3次，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，增强型化学发光试剂下显影，进行图像分析。

1.2.6 平板克隆试验 在转染48 h后对转染想细胞进行收集、重悬、计数，在6孔细胞培养板中接种并培养10 d，使用PBS溶液浸洗2次，然后加1 ml甲醇进行固定，15 min，弃去固定液，加结晶紫染液进行10min染色，使用自来水进行冲洗，在倒置显微镜下对至少50个细胞观察，记录集落细胞所形成的克隆数量。

1.2.7 CCK-8法检测 使用CCK-8试剂盒检测乳腺癌细胞活力，首先将对数生长期的细胞进行重悬，然后接种96孔细胞培养板，在转染后1～5 d分别向96孔板中加入CCK-8、10微升/孔，低速震荡10 s，再积血培养2 h，酶标仪检测，并在450 nm部位记录A值，绘制上肢曲线。

1.2.8 流式细胞术 将转染48 h后的两组细胞分别进行收集，使用PBS溶液进行次清晰，400 μl细胞结合液重悬细胞，分别加入5 μl Annexin V-FITC以及10 μl PI中，在4 ℃下避光反应30 min，应用流式细胞仪对结果进行检测，分析细胞凋亡率。

1.3 数据处理

2 结果

2.1 miR-382-5p在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达

观察组样本miR-382-5p与对照组相比呈现显著低表达，且具有统计学差异(P<0.05)，见表1。

表1 miR-382-5p在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达情况

2.2 转染后的MCR-7细胞miR-382-5p和NF90表达

观察组转染后的MCR-7细胞miR-382-5p表达量高于对照组，且具有统计学差异(P<0.05)，但观察组细胞中NF90 mRNA较对照组明显降低，且均具有统计学差异(P<0.05)，见表2。

表2 转染后的MCR-7细胞miR-382-5p和NF90表达情况

2.3 miR-382-5p对多种蛋白表达的影响

细胞转染48 h后， Western blot法检测结果显示：MCF-7细胞转染miR-382-5p后NF90、Bcl-2蛋白表达观察组较对照组明显下调，p53、p21、Bax观察组较对照组明显上调，Cyclin E1蛋白无明显变化，见图1。

图1 Western blot法检测miR-382-5p对多种蛋白表达的影响

2.4 平板克隆试验结果

观察组患者克隆形成数低于对照组，细胞凋亡率高于对照组，且具有统计学差异(P<0.05)，见表3。

2.5 miR-382-5p对乳腺癌细胞MCF-7活力影响

采用CCK法检测不同时间点MCF-7细胞生长，在细胞生长第4、5天，观察组细胞活力低于对照组，且具有统计学差异(P<0.05)，细胞生长1、2、3天两组细胞活力无统计学差异(P>0.05)，见图2。

2.6 miR-382-5p对乳腺癌细胞MCF-7凋亡的影响

经过流式细胞术检查，显示MCF-7细胞转染miR-382-5p后凋亡率高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 两组样本平板克隆试验结果比较

图2 miR-382-5p对乳腺癌细胞MCF-7活力影响

3 讨论

微小RNA(miRNA)是长约22nt的非编码RNA，在生物界广泛存在，从病毒到人类中皆有发现。miRNA能够与mRNA相结合，起到阻断蛋白编码基因表达的作用，从而阻止蛋白编码基因翻译成为蛋白[5]。既往的研究认为miRNA与结直肠癌具有密切的关系[6]。目前已经发现的miRNA超过3000个，大部分在动物体内的基因调控中起到重要的作用，是机体内最为主要的基因表达调控因子之一[7]。有研究认为人体内超过66.67%的基因均接受某一个或者一组miRNA的调控[8]。

miR-382-5p是miRNA家族中的成员，研究发现其在多种类的肿瘤发生、发展过程中起到重要的调控作用[9]。有文献报道，miR-382-5p表达水平与骨肉瘤复发率呈负相关，即miR-382-5p水平越好，骨肉瘤复发率越低[10]。此外，miR-382-5p在卵巢癌组织和细胞中表现出下调的趋势，能够抑制乱猜细胞的增殖，并在上皮间充质化过程中起到重要的作用。在这一过程中miR-382-5p的靶标为酪氨酸激酶孤儿受体1[11]。结直肠癌中miR-382-5p也出现明显的表达下调，与3’UTR直接结合后具有阻碍结直肠癌细胞生长、侵袭的作用。miR-382-5p与食道癌预后密切相关，其表达越低，食管癌预后越差[12]。在非小细胞肺癌中miR-382-5p出现明显下调，其直接靶标为SETD8。但是miR-382-5p在乳腺癌中的作用相关文献报道较少。

本次研究选择了86例乳腺癌患者病理标本进行临床研究，结果发现观察组样本miR-382-5p与对照组相比呈现显著低表达，且具有统计学差异(P<0.05)，说明在乳腺癌组织中miR-382-5p的表达量降低，对癌细胞的调控能力减弱。从转染上看，观察组转染后的MCR-7细胞miR-382-5p表达量高于对照组，但观察组细胞中NF90 mRNA较对照组明显降低，细胞转染48h后， Western blot法检测结果显示MCF-7细胞转染miR-382-5p后NF90、Bcl-2蛋白表达观察组较对照组明显下调，p53、p21、Bax观察组较对照组明显上调，Cyclin E1蛋白无明显变化，说明miR-382-5p具有抑制癌细胞转移和分化的能力。观察组患者克隆形成数低于对照组，细胞凋亡率高于对照组，且具有统计学差异(P<0.05)，采用CCK法检测不同时间点MCF-7细胞生长，在细胞生长第4、5天，观察组细胞活力低于对照组，且具有统计学差异(P<0.05)，说明miR-382-5p具有抑制肿瘤细胞生长的作用。细胞生长1、2、3天两组细胞活力无统计学差异(P>0.05)，经过流式细胞术检查，显示MCF-7细胞转染miR-382-5p后凋亡率高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明miR-382-5p具有调控肿瘤细胞凋亡的作用，因此miR-382-5p在乳腺癌的增殖和凋亡中具有重要作用，能够抑制细胞的增殖能力，进一步提示miR-382-5p在乳腺癌中起到抑癌基因的作用，因此考虑乳腺癌的发生发展与miR-382-5p的表达缺失具有相关性[13]。

综上所述，miR-382-5p具有抑制乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡的作用，其基因与靶向抑制NF90基因具有相关性。miR-382-5p的作用机制可能与靶向作用核因子蛋白90相关，因此，miR-382-5p在癌组织中出现明显的表达下调，这提示miR-382-5p的研究为乳腺癌的诊断和治疗提供了新的途径。但是本次研究的临床样本量较小，且乳腺癌具有高度的异质性，因此应该进一步研究不同类型的乳腺癌中miR-382-5p水平的表达差异，为miR-382-5p在乳腺癌的诊断和治疗中提供可靠数据。