丹参酮ⅡA对2型糖尿病合并动脉粥样硬化患者炎症反应的影响*

朱静和 蒋凤 吴加滨

（江苏省盐城市滨海县人民医院 滨海224500）

2型糖尿病（T2DM）以胰岛素抵抗为特征，是动脉粥样硬化（AS）发病的重要危险因素[1]。AS已被认为是许多心血管疾病的基本病理改变，血管病变的发展是T2DM患者死亡的主要原因之一[2]。单核细胞通过与受损血管内皮细胞上表达的黏附分子结合，在AS进展的第一步发挥重要作用。单核细胞迁移到内皮下间隙成熟为巨噬细胞，最终分化成泡沫细胞，在炎症部位释放促炎和促氧化细胞因子[3]。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）是炎症反应的重要生物标志物，可通过诱导氧化应激和内皮功能障碍参与AS的发展[4]。丹参酮ⅡA是丹参中的一种亲脂性药理活性化合物，具有抗炎作用，并在各种炎症条件下表现出保护作用[5]，但其在ox-LDL诱导的人外周血单核细胞炎症反应中的作用尚不清楚。本研究探讨丹参酮ⅡA对T2DM合并AS患者炎症反应的影响。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2019年2～9月收治的T2DM合并AS患者90例为研究对象，根据随机数字表法分为对照组（45例）和观察组（45例）。T2DM的诊断与分类依据《中国2型糖尿病防治指南（2013年版）》[6]。AS通过血管造影诊断，符合美国心脏学会2013年发布的相关标准[7]。排除标准：1型糖尿病；合并T2DM急性并发症；其他急性临床情况或严重疾病（如严重肝肾功能不全、严重感染、脓毒症或恶性肿瘤等）；其他内分泌或自身免疫性疾病；服用可能影响全身致炎因子水平的激素制剂或免疫抑制剂等。本研究获医院医学伦理委员会批准，患者及家属对研究内容知情并签署知情同意书。两组年龄、性别、单核细胞绝对值、血糖、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。

表1 两组一般资料比较（±s）

表1 两组一般资料比较（±s）

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1.2 治疗方法 对照组和观察组均给予常规降血糖治疗：二甲双胍（国药准字H20023370）0.5 g/次，口服，3次/d；阿卡波糖（国药准字H19990205）50 mg/次，随餐服，3次/d。观察组在标准常规治疗的基础上加丹参酮ⅡA注射液治疗，80 mg丹参酮ⅡA注射液（国药准字H31022558）加入250 ml 0.9%氯化钠注射液稀释，静脉滴注，1次/d，疗程为2周。控糖目标：空腹血糖4.4～7.0 mmol/L，餐后2 h或随机血糖＜10.0 mmol/L。常规药物治疗后，两组患者血糖均达标。

1.3 两组治疗前后血清细胞因子浓度检测 抽取两组用药前后患者空腹静脉血2 ml，离心分离血清，保存于-80℃用于批量检测。利用Luminex200流式荧光检测仪，据试剂盒说明书（美国密理博公司）提供的操作步骤检测肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细 胞 介 素（IL）-6、IL-1β和 细 胞 间 黏 附 分 子-1（ICAM-1）浓度，每个样本检测2次，取均值。

1.4 分离培养健康供者及T2DM合并AS患者外周血单核细胞 于治疗前采集健康供者5例及T2DM合并AS患者5例外周血8 ml，250 g离心20 min，去除上层（富含血小板）；剩余血液与生理盐水混合，650 g离心20 min，进行葡聚糖沉降，收集上层（富含白细胞），室温下500 g离心5 min，将颗粒重新悬浮在含葡萄糖的Hank's平衡盐溶液中。利用Percoll密度梯度在700 g下进行离心15 min，收集界面层并用含葡萄糖的Hank's平衡盐溶液洗涤。将颗粒重新悬浮在含有10%FBS的RPMI-1640中黏附单核细胞1 h。通过台盼蓝染色检测细胞活力约95%，流式细胞仪检测CD14+细胞纯度约95%。

1.5 体外刺激培养健康供者及T2DM合并AS患者单核细胞 收集上述培养细胞，分为6组：A组健康供者空白组；B组健康供者ox-LDL（北京索莱宝科技有限公司）处理组；C组健康供者丹参酮ⅡA（美国Sigma公司）+ox-LDL处理组；D组T2DM合并AS患者空白组；E组T2DM合并AS患者ox-LDL处理组；F组T2DM合并AS患者丹参酮ⅡA+ox-LDL处理组。丹参酮ⅡA（1μm）培养1 h后，加或不加ox-LDL（40μg/ml）继续孵育48 h，收集细胞。通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.6 单核细胞中致炎因子水平检测 收集上述分组细胞，采用RT-PCR（Applied Biosystems公司）检测 各 组 细 胞IL-1βmRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA和ICAM-1 mRNA表达水平。采用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取总RNA，cDNA反转录试剂合成cDNA，通过QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒进行扩增。引物序列：IL-1β，正义链5'-CTCTCACCTCCTACTCAC-3'，反义链5'-ACACT GCTACTTTCCCC-3'；IL-6，正义链5'-CCACTGCCT TCCCTACTTCA-3'，反义链5'-TGGTCCTTAGCCA CTCCTTC-3'；TNF-α正义链5'-GCAGAAAATGCC AGGATGATG-3'，反义链5'-GGCTGTCAGAGCCT CGTGGCTTTGG-3'；ICAM-1，正义链5'-AAAAGCG GAGACAGGAGACA-3'，反义链5'-AGCACGAGAA GCTCAGGAGA-3'；β-肌动蛋白，正义链5'-CTGGG CTACACTGAGCACC-3'，反义链5'-AAGTGGTCG TTGAGGGCAATG-3'。采用三步循环方案，95℃初始变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s进行扩增。使用2-ΔΔCt方法计算实验样品和校准样品之间的相对折叠差，以β-肌动蛋白为内标计算相对表达量。

1.7 统计学分析 数据统计分析采用GraphPad Prism7.0软件。计数资料以%表示，采用χ2检验；计量资料以（±s）表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗前后血清细胞因子浓度比较 两组治疗前血清TNF-α、IL-6、IL-1β和ICAM-1浓度比较无显著性差异（P＞0.05）。与对照组及观察组用药前相比，观察组在使用丹参酮ⅡA 2周后血清TNF-α、IL-6、IL-1β和ICAM-1浓度明显降低（P＜0.05）。见表2。

表2 两组治疗前后血清细胞因子浓度比较（pg/ml，±s）

表2 两组治疗前后血清细胞因子浓度比较（pg/ml，±s）

注：与对照组用药前比较，*P＜0.05；与观察组用药前比较，#P＜0.05。

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2.2 丹参酮ⅡA+ox-LDL处理后单核细胞凋亡率检测 与空白对照组相比，ox-LDL处理组单核细胞凋亡率增加（P＜0.05）；与ox-LDL处理组相比，丹参酮ⅡA+ox-LDL处理组单核细胞凋亡率降低（P＜0.05）。T2DM合并AS患者空白组单核细胞凋亡率与健康供者空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与健康供者ox-LDL处理组相比，T2DM合并AS患者ox-LDL处理组单核细胞凋亡率增加（t=2.645；P=0.021 4）；与健康供者丹参酮ⅡA+ox-LDL处理组相比，T2DM合并AS患者丹参酮ⅡA+ox-LDL处理组单核细胞凋亡率增加（t=2.721，P=0.018 6）。见表3、图1。

表3 各组单核细胞凋亡率检测（%，±s）

表3 各组单核细胞凋亡率检测（%，±s）

注：与A组比较，t=6.663，*P=0.000 2，与B组比较，t=7.285，#P＜0.000 1；与D组比较，t=4.213，**P=0.002 9，与E组比较，t=4.074，##P=0.003 6。

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图1 各组单核细胞凋亡率检测

2.3 丹参酮ⅡA抑制健康供者及T2DM合并AS患者单核细胞中炎症介质表达 体外通过ox-LDL及丹参酮ⅡA培养健康供者及T2DM合并AS患者单核细胞，发现与空白组相比，ox-LDL处理组单核细胞中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、IL-1βmRNA和ICAM-1 mRNA表达升高（P＜0.05）；与ox-LDL处理组相比，丹参酮ⅡA+ox-LDL处理组单核细胞中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、IL-1βmRNA和ICAM-1 mRNA表达降低（P＜0.05）。见表4、表5。

表4 健康供者单核细胞中炎症介质表达（±s）

表4 健康供者单核细胞中炎症介质表达（±s）

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表5 T2DM合并AS患者单核细胞中炎症介质表达（±s）

表5 T2DM合并AS患者单核细胞中炎症介质表达（±s）

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3 讨论

AS是T2DM常见的并发症，常进展为心肌梗死和脑卒中，是T2DM患者致残和致死的重要原因。导致AS发展的危险因素包括高血糖、低密度脂蛋白胆固醇升高和TG升高。与糖尿病相关的脂蛋白紊乱通过促进斑块和ox-LDL在血管系统中的积聚在AS的发展中发挥重要作用[8]。AS是一种心血管疾病过程，脂质斑块形成并聚集在中等大小的动脉内膜上，导致动脉管壁硬化，动脉变窄，最终导致动脉阻塞，从而阻止血管系统发挥提供充足氧气和营养的功能，并破坏全身内环境稳态[9]。与正常人群相比，糖尿病患者患心血管疾病的风险高出4倍以上[10]。

先天免疫反应和炎症的主要调节因子是单核巨噬细胞，它们参与先天免疫和炎症相关的病理过程，包括自体炎症疾病、脓毒症、癌症或AS[11]。单核巨噬细胞在炎症反应中的许多先天功能是由细胞因子介导的。IL-6、TNF-α及IL-1是先天炎症反应的中心介质。本次通过对AS患者促炎性细胞因子的研究，以考察丹参酮ⅡA对该病的治疗作用。本研究发现，与对照组及观察组用药前相比，观察组在使用丹参酮ⅡA2周后血清TNF-α、IL-6、IL-1β和ICAM-1浓度明显降低。

单核细胞通过与受损的血管内皮细胞上表达的黏附分子结合，迁移到内皮下空间，成熟为巨噬细胞，并通过A类清道夫受体和CD-36摄取氧化低密度脂蛋白，最终分化成泡沫细胞，在炎症部位释放促炎和促氧化细胞因子[3]。AS是与ox-LDL积聚有关的主要心血管疾病之一[12]。最近的报道表明，ox-LDL可通过诱导氧化应激、线粒体功能障碍、促炎性细胞因子和趋化因子的表达，包括IL-1β、IL-6和单核细胞趋化蛋白1，黏附分子包括ICAM-1和E-选择素，下调Kruppel-like factor 2转录因子的表达，从而推动AS的发生[8]。

为了进一步说明丹参酮ⅡA在AS疾病过程中的抑炎作用，本研究通过体外实验建立ox-LDL刺激单核细胞的炎症模型。发现与空白对照组相比，ox-LDL处理组单核细胞凋亡率增加，单核细胞中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、IL-1βmRNA和ICAM-1 mRNA表达升高；与ox-LDL处理组相比，丹参酮ⅡA+ox-LDL处理组单核细胞凋亡率降低，单核细胞中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、IL-1βmRNA和ICAM-1 mRNA表达明显降低。

IL-1β在AS和心血管事件的发生和发展中起重要作用，使用IL-1阻断剂与降低总体主要心血管不良事件（MACE）、不稳定型心绞痛和心力衰竭复发的风险相关[13]。IL-6是一种重要的致AS的细胞因子[14]。这种多功能促炎性细胞因子由T淋巴细胞、巨噬细胞和脂肪细胞产生，并通过其膜结合受体或可溶性受体发挥作用[15]。IL-6在血管壁对单核细胞的自分泌和旁分泌的激活有助于炎症沉积。IL-6还降低血浆中脂蛋白脂肪酶活性和单体脂蛋白脂肪酶水平，从而增加巨噬细胞对脂质的摄取，从而导致泡沫细胞的形成。在AS发生发展过程中，促炎性细胞因子（如IL-6、TNF-α等）与血管炎症有关[16]。TNF-α在单核细胞黏附和内皮功能障碍方面具有协同效应。IL-6通过反式信号转导增加内皮细胞的活化，诱导内皮细胞上黏附分子（如ICAM-1等）的表达。

综上所述，体内实验证实观察组在使用丹参酮ⅡA2周后，患者血清TNF-α、IL-6、IL-1β和ICAM-1浓度明显降低。体外实验证实丹参酮ⅡA可显著降低ox-LDL处理的单核细胞中促炎性细胞因子表达，这些结果表明丹参酮ⅡA具有抗炎、抗细胞凋亡的性质，有望缓解T2DM患者AS的进程。但本次所选病例较少，药物治疗周期较短，后续仍需大量实验多方面验证丹参酮ⅡA的抗炎效能。