人工授精后不同阶段葡萄糖、孕酮和雌二醇含量对奶牛妊娠预测的研究

张 萌 ，王俊奎，杨玉东，李艳艳，王 敏，罗 芳，和东迁，陈丽尧，陶金忠*

（1.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021；2.宁夏农垦贺兰山奶业有限公司，宁夏银川 750021；3.内蒙古圣牧控股有限公司，内蒙古巴彦淖尔 015000）

孕酮（P4）和雌二醇（E2）对奶牛生殖内分泌系统和发情周期有着重要作用。奶牛的生殖道和发情周期的行为变化在很大程度上受卵泡E2和黄体P4浓度影响[1]。P4浓度升高与奶牛妊娠率的增加有关[2]。而发情前期E2浓度升高，诱导P4受体，抑制催产素受体活性，进而阻止了黄体溶解，也有利于奶牛胚胎的存活[3]。

奶牛大部分胚胎丢失发生在母畜和胚胎建立联系之前的妊娠早期，70%～80%的胚胎丢失发生在人工授精后的前两周[4]。Diskin 等[5]研究发现，40% 奶牛的受孕失败会发生在妊娠第9～17 天（排卵为第1 天）。而对奶牛晚期胚胎丢失研究发现，奶牛在第28～84 天的胚胎损失率为7.2%[6]。对能量需求方面，血液中葡萄糖（GLU）浓度增加为后期妊娠的建立和维持做好子宫准备[7]。GLU 对奶牛卵母细胞成熟发育到囊胚期具有影响，当胚泡扩张和囊胚伸长时期对GLU 利用增加[8]。本研究通过分析奶牛人工授精后血浆中GLU、P4和E2浓度的变化，探讨这些物质变化对妊娠的影响，以期为奶牛早期妊娠预测提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 血液的采集保存和试验设计 在宁夏某大型奶牛场，选择63 头2～3 胎、3～4 岁和体况评分（ВCS）2.75 左右的健康荷斯坦奶牛。奶牛同情发情处理后分别在发情当天人工授精，人工授精当天为采样第1 天。人工授精当天（第1 天）、授精后第5 天、第17 天和第28 天早晨饲前进行尾静脉采血10 mL，肝素钠抗凝，迅速3 000 r/min 离心10 min，使用冷冻管收集上层血浆，置于-80℃冰箱冷冻保存，以备后续分析。采用计步器进行发情鉴定，使用В 超仪于32 d 时进行妊娠检测，根据检测结果（当妊娠检测前奶牛返情作为返情组，妊娠检测奶牛未妊娠为未妊娠组，妊娠奶牛即为妊娠组），将奶牛分为妊娠组（n=24）、未妊娠组（n=19）、返情组（n=20）3 组。

1.2 指标测定方法 P4和E2采用酶联免疫试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）测定，具体操作严格按照说明书进行。使用血糖仪（三诺生物传感股份有限公司产安稳型）测定血浆中的GLU，血糖试条购自三诺生物传感股份有限公司。

1.3 统计分析 数据经过Excel 整理后，使用SPSS 22.0 进行One-Way ANOVA 单因素方差分析，分析试验数据结果均用平均值± 标准差表示，P＜0.01 表示差异极显著，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果

由表1 可知，人工授精后第5 天妊娠和未妊娠组血浆中P4高于返情组（P＜0.01）；人工授精后第17 天返情和妊娠组血浆中P4高于未妊娠组（P＜0.01）；人工授精后第28 天未妊娠组血浆中P4高于返情组（P＜0.05）。人工授精后第5 天妊娠和未妊娠组血浆中E2高于返情组（P＜0.01）；人工授精后第17 天返情和妊娠组血浆中E2高于未妊娠组（P＜0.01）。人工授精后第17 天时返情和妊娠组血浆中P4/E2高于未妊娠组（P＜0.01）；人工授精后第28 天时妊娠组血浆中GLU 含量高于返情组（P＜0.05），其他阶段各项指标差异不显著。

3 讨论

3.1 P4含量对妊娠的影响 许多研究已经证明，P4对奶牛妊娠的建立、维持和胚胎的正常发育具有重要作用。为了最大限度提高奶牛的胚胎存活率，需要一个最佳的P4浓度环境来建立成功妊娠。而发情早期升高P4浓度调节子宫环境和组织营养物质的分泌来影响胚胎的发育[9]。有研究发现，在排卵后第4 天至第6 天，乳中P4浓度与奶牛胚胎存活率之间存在正相关系[10]。本研究中人工授精后第5 天妊娠组和返情组、未妊娠组和返情组均差异极显著，妊娠组和未妊娠差异不显著。而授精后第20 天之前P4浓度过低会导致奶牛中止妊娠，即在母体识别胚胎之前发生胚胎丢失[11]。本研究中，人工授精后第17 天血浆P4浓度未妊娠组与妊娠组和返情组差异极显著，妊娠组和返情组差异不显著，且人工授精后的第5～17 天妊娠组奶牛血浆中P4基本保持稳定。这可能是人工授精后第5 天妊娠组和未妊娠组奶牛胚胎细胞发育正常，人工授精后第17 天胚胎和母体识别时未妊娠组奶牛囊胚发育受损。因此人工授精后第5～17 天提高血浆P4浓度有利于提高奶牛胚胎存活率。

3.2 E2含量对妊娠的影响 E2是调节哺乳动物生殖过程的重要激素，E2不仅能促进自身受体的表达，还能促进P4受体的表达[12]。有研究发现牛血清E2与受精和胚胎存活呈正相关[13]。Rafael 等[14]使用酶联免疫分析法检测授精后第4、7 天血液中E2，发现平均E2浓度在妊娠周期和非妊娠周期间无显著性差异。本研究中，人工授精后第5 天，妊娠组和未妊娠组E2差异不显著，返情组与妊娠组和未妊娠组差异极显著。有研究发现奶牛妊娠识别大约发生在授精后第15 天，并且接纳孕体的最晚时间必须早于第17 天[15]。本研究中，未妊娠组人工授精后第17 天血浆E2浓度与妊娠组和返情组差异极显著，妊娠组和返情组差异不显著，且人工授精后第5～17 天妊娠组奶牛血浆中E2基本保持稳定。这可能是E2和P4共同影响奶牛妊娠，在人工授精后第17 天在胚胎和母体识别时发挥重要作用。

表1 返情、妊娠和未妊娠奶牛血浆各项指标含量

3.3 P4/E2比值对妊娠的影响 以往研究发现，血清P4/E2比值的联合评估比单独测定P4水平预测妊娠结果更准确[16]。P4/E2比值也可以用于辅助生殖技术中妊娠的预测[17]。有研究发现妊娠奶牛P4浓度在授精时较低，在第13 天达到最高水平，除了在第19 天和第41 天有轻微下降外，在怀孕的第一个，第二个和怀孕中期都保持该水平；而授精当天E2水平较高，其后浓度基本保持在稳定范围内波动[18]。这与本研究中妊娠组结果一致。本研究中在人工授精后第17 天时妊娠组和返情组血浆P4/E2极显著高于未妊娠组，妊娠组和返情组差异不显著。此时血浆P4/E2差异较大，所以采用人工授精后第17 天血浆中P4/E2比值预测妊娠可能较为理想。

3.4 GLU 含量对妊娠的影响 GLU 是动物机体主要的供能物质，也是影响奶牛生育能力的一个因素。在胚胎着床前，胚胎与母体之间已经建立了联系，需要子宫滋养层提供大量GLU 供应胚胎发育[19]。当血糖降低时导致胎盘中GLU 含量减少和胎儿发育减慢，母体的GLU含量越低，胎儿体内GLU 含量就越低[20]。已有研究表明GLU 不足也是怀孕早期胚胎丢失因素之一[21]。人工授精后第28 天时返情组和妊娠组差异显著，其他各阶段各组之间差异不显著，从人工授精后第5～28 天妊娠组奶牛血浆GLU 总体水平高于其他2 组。人工授精后母体对胚胎提供能量，并支持其生长发育，低浓度GLU 不利于奶牛妊娠。

4 结论

本研究发现在奶牛人工授精后第5～17 天妊娠奶牛P4和E2浓度维持相对稳定，且高浓度的P4和E2有利于奶牛妊娠，第28 天低浓度的GLU 不利于妊娠。