贵州黑山羊ADΙPOQ基因组织表达分析及脂肪中表达规律研究

杨 洋，陈浩林*，徐 敏，倪 锴

（1.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵州贵阳 550025；2.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025）

ADΙPOQ 又称脂联素或脂肪连接蛋白（Adiponetin），是一种具有生物活性的脂肪因子，由脂肪组织分泌[1]。ADΙPOQ基因最初在人类染色体上被发现，对生理功能的调控主要是通过与ADΙPOQ受体结合，然后对AMP激酶与PPAR 配体的活性进行调节，从而调控脂肪氧化和细胞糖类的摄取[2]。ADΙPOQ基因主要与胰岛素耐受性调节、Ⅱ类糖尿病以及机体肥胖等多种生理疾病相关[3]，随着对该基因的深入研究，发现ADΙPOQ基因在脂质代谢的调控中也具有重要作用，已有研究发现ADΙPOQ基因在脂质代谢上的调控作用主要是通过促进脂肪酸氧化和抑制脂质合成达到降脂的作用[4]。迄今为止，对于ADΙPOQ基因在调控动物脂质代谢上的研究主要集中在人类和啮齿动物上[5]，在畜禽上的研究相对较少。在猪上的研究发现，ADΙPOQ基因的组织特异性表达与脂肪沉积有关[6]；在肉牛育肥前期，ADΙPOQ基因表达水平与肌内脂肪含量呈正相关，育肥后期则与肌内脂肪含量呈负相关[7]。以上研究表明ADΙPOQ基因在脂肪合成代谢中起到重要作用，且可能是影响肌内脂肪的重要候选基因。目前关于ADΙPOQ基因在贵州黑山羊上的研究尚没有报道，因此本实验通过对ADΙPOQ基因在黑山羊不同组织变动分析及脂肪组织的时序表达研究，探讨ADΙPOQ基因对黑山羊肉质的调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样品 采集12 月龄贵州黑山羊心、肝、脾、肺、肾、胃、背最长肌和脂肪组织以及1 月龄、3 月龄、6 月龄、9 月龄和12 月龄5 个不同时间段的黑山羊脂肪组织。

1.1.2 主要试剂 荧光定量试剂盒，购自上海索莱宝生物科技有限公司；TRΙzol 试剂、无水乙醇、氯仿、异丙醇、75%酒精，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；逆转录试剂盒、琼脂糖，购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器 微量紫外分光光度计、实时荧光定量PCR 仪，均购自Thermo Scientific；超净工作台，购自苏州净化设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据NCВΙ 上山羊ADΙPOQ基因的mRNA 序列（登录号：NM_001287573.1），使用Primer5.0 软件设计ADΙPOQ基因的上下游荧光引物，将设计的引物序列交由赛默飞世尔科技（中国）有限公司进行合成，GAPDH基因作为荧光定量的内参基因，设计合成序列及内参基因序列信息见表1。

表1 引物信息

1.2.2 组织RNA 的提取 将采集的各组织样品用TRΙzol 法进行组织RNA 提取，并将提取的RNA 通过紫外分光光度计检测其纯度和浓度，各组织样品RNA OD 值在1.8～2.0。

1.2.3 cDNA 的合成 将提取的组织RNA 按照逆转录试剂盒的说明书进行逆转录合成cDNA，反应总体系20 μL：RNA 模板1 μL、Primer Mix 1 μL、dNTP Mix 2 μL、5×RT Вuffer 4 μL、Ribo Lock RNase Ιnhibitor1 μL、Revert Aid M-Mu LV RT 1 μL、ddH2O 10 μL。反应条件为65℃5 min，42℃ 60 min，25℃ 5 min，70℃终止反应 5 min。

1.2.4 组织荧光定量PCR 将逆转录得到的黑山羊各组织和不同阶段脂肪组织cDNA 经荧光定量PCR 检测ADΙPOQ基因的表达，荧光定量PCR 反应体系为25 μL：各组织cDNA 模板（100 ng/μL）1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，荧 光 染 料12.5 μL，无酶水9.5 μL。荧光 定量反应条件为：95℃ 预变性3.5 min；95℃变性 10 s，58.5℃退火30 s，40 个循环；每个组织样采用3 个重复组。

1.2.5 统计分析 将荧光定量反应得到的数据经2-ΔΔCt方法进行分析处理后，再使用SPSS19.0 对分析得到的数据进行单因素方差分析，P＜0.01 代表差异极显著，P＜0.05 代表差异显著。

2 结果与分析

2.1 黑山羊不同组织ADΙPOQ基因表达分析 设计引物经测序比对，结果与设计合成序列一致，且经荧光定量PCR 反应，ADΙPOQ基因与内参GAPDH基因的扩增曲线均呈现“S”型，且拐点清晰，熔解曲线均只有一个峰，说明荧光引物特异性较好（图1、图2）。荧光定量PCR 结果显示，ADΙPOQ基因在黑山羊检测的各组织中均有表达，说明表达具有广谱性；ADΙPOQ表达量从高到低依次为脂肪、背最长肌、脾、肺、肝、胃、心、肾；脂肪组织中表达量极显著高于其他组织；背最长肌与脾中的表达量均极显著高于肺、肝、胃、心等组织中的表达，在背最长肌和脾中的表达量无显著差异。ADΙPOQ在肺和肝中的表达量极显著高于胃、心和肾中的表达量，在肺与肝中的表达量无显著性差异。ADΙPOQ在胃和心中的表达量极显著高于肾的表达量，在胃和心中的表达量无显著性差异（图3）。

2.2ADΙPOQ基因在脂肪组织中的时序表达分析 由图4可见，ADΙPOQ基因整体的表达趋势先升高再降低，其中在6 月龄黑山羊脂肪组织中表达量最高，在12 月龄表达量最少，在6 月龄与3 月龄的表达量极显著高于1 月龄、9 月龄和12 月龄，而在6 月龄与3 月龄之间表达量无显著差异，在1 月龄的表达量极显著高于9 月龄和12 月龄，在9 月龄和12 月龄之间的表达量无显著差异。

3 讨论

ADΙPOQ 主要是由脂肪组织分泌，而前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的过程中有很多调控因子起到调控的作用[8]，ADΙPOQ基因参与血脂血糖代谢、炎症等病理生理过程。张辉[9]等研究结果表明，ADΙPOQ基因在牛的脂肪代谢过程中起到重要作用。丛立新[10]等研究表明，ADΙPOQ基因的特异表达与其背膘厚度具有一定的相关性。Wang[11]等研究结果显示，ADΙPOQ基因在猪的脂肪细胞中表达丰富，同时有研究发现该基因在鸡和鸭的脂肪组织中的表达量均最高[12-13]，本实验结果与上述研究结果相一致，说明ADΙPOQ基因的表达在不同物种脂肪组织中均起到重要作用。李雪梅[14]等研究了ADΙPOQ基因在藏山羊不同组织中的表达模式，结果显示ADΙPOQ基因在脂肪组织中表达量最高，在肌肉组织和胃中表达量较低，而在其他各组织中未检测到表达。而本研究中，ADΙPOQ基因在黑山羊脂肪组织中表达量最高，在胃中表达量较低，但在其他组织中均检测到了ADΙPOQ基因的表达，且在背最长肌中的表达量较高，由此可说明在不同品种山羊的组织中，ADΙPOQ基因的表达有一定差异性。通过在荷斯坦新生犊牛前体脂肪细胞体外单层贴壁培养中的研究发现，ADΙPOQ基因在前体脂肪细胞不同的培养时期均有表达，而且ADΙPOQ基因的表达水平随着脂肪细胞分化的成熟逐渐增高，到培养的12 d 表达最高[15]。而本研究发现，随着黑山羊年龄的逐渐增长，ADΙPOQ基因的表达量先增加再减少，在6 月龄的表达量达到最高，这可能与6 月龄时黑山羊肌内脂肪含量较高有关。同时在延边黄牛脂肪组织的研究结果显示，ADΙPOQ基因的表达与肌肉内脂肪的含量呈正相关关系[16]。由此可以说明ADΙPOQ基因的表达在脂肪细胞的分化过程中和脂质的集聚过程中可能起到一定的促进作用。

4 结论

本实验通过对黑山羊不同组织中ADΙPOQ基因表达的分析和不同时期脂肪组织中的表达规律研究表明，ADΙPOQ基因在12 月龄黑山羊不同组织中均有表达，且在脂肪组织中表达量最高；ADΙPOQ基因在1 月龄到12 月龄黑山羊脂肪组织中的表达呈现逐渐增加随后减少的趋势，且在6 月龄表达量最高，本研究结果为进一步研究ADΙPOQ基因对脂肪代谢的调控机制奠定基础。