重组酶聚合酶扩增法在婴幼儿食品克罗诺杆菌检测中的应用

郝娟，吴婕，佘之蕴，张娟

（1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所农业农村部功能食品重点实验室广东省农产品加工重点实验室，广州510610；2.广州力衡临床营养品有限公司，广州510610；3.广东产品质量监督检验研究院，广东佛山528300）

0 引 言

克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）是一类革兰氏阴性无芽孢杆菌，一种重要的条件致病菌。克罗诺杆菌属于2008年由Iversen等建立[1-3]，之前被称作阪崎肠杆菌（Enterbacter sakazakii）。Strydom等于2012年根据DNA杂交、表型分型、16SrRNA测序和多序列分析法对该属菌株进行重新分类，确定其包括7个种和3个亚种[4]。该菌感染新生儿可引起脑膜炎、菌血症、坏死性小肠结肠炎等疾病[5]，并可引起严重的神经系统后遗症和较高的死亡率。婴幼儿配方乳粉是感染克罗诺杆菌的主要渠道。我国国家标准中均明确规定0～6月龄婴幼儿配方食品不得检出克罗诺杆菌，而婴幼儿辅助食品中克罗诺杆菌的限量在国内外均未做出相应规定。基于此，针对免疫力低下的群体，该菌的污染存在一定的风险。

目前，克罗诺杆菌的实验室检测方法主要是传统的分离培养法，但因为检测周期长，无法及时应对突发事件。随着分子生物学检测技术的发展，各种快速检测技术应运而生，缩短了检测时间，提高了检测效率[6-7]。但这些技术存在需要使用复杂的仪器，对操作人员要求高等问题，限制了其在应急检测中的应用。核酸恒温扩增技术由于无需特殊设备，反应速度快，灵敏度高等特点，在诸多领域已经得到广泛应用。重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）作为一种新型的恒温扩增技术，反应模式与PCR类似，但不需要加热变性步骤，而是利用重组酶代替高温解链，采用单链结合蛋白防止DNA复性，整个反应仅需15～20 min完成。相对比较成熟的环介导等温扩增技术，RPA引物设计简单，无需加热反应，扩增产物可进行后续分析。本研究以重组酶聚合酶扩增法为主要检测技术，对比国家标准方法和荧光定量检测方法的结果，调查婴幼儿食品中克罗诺杆菌的污染状况。

1 材料与方法

1.1 样品来源

样品采购自大型商场、超市、母婴店、药店及网购的国产和进口婴幼儿配方乳粉以及婴幼儿谷物食品，共196个品牌560份样品，样品包装完整且均在保质期内。

1.2 材料与设备

培养基：BPW 培养基、改良月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤—万古霉素(mLST-Vm)肉汤、胰蛋白大豆琼脂(TSA)、阪崎肠杆菌显色培养基(DFI)。

试剂：Premix Taq DNA聚合酶；食品基因组提取试剂盒；细菌基因组提取试剂盒；RAA荧光检测试剂盒；所用引物和探针由上海生工生物公司合成。

设备：CL-40M高压灭菌锅；GHP-9160隔水式恒温培养箱；AC2-6S1生物安全柜；玻璃热珠灭菌器；Easy-mix拍击式均质器；dilumat S电子稀释器；Nanodrop 2000微量紫外分光光度计；QuantStudio 7 Flex荧光PCR仪；DK-8D电热恒温水槽；3-30K高速冷冻离心机。

1.3 实验方法

1.3.1 国家标准方法检测克罗诺杆菌

按照GB 4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验》的检测流程进行检验。无菌条件下取检样100 g加入900 mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水中，充分溶解后于36±1℃培养18±2 h。移取1m L转种于10 mL（mLST-Vm）肉汤，44±0.5℃培养24±2 h。各取增菌液1环，分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板，36±1℃培养24±2h。挑取可疑菌落划线接种于TSA平板，25±1℃培养48±4 h。自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，用VITEK2全自动微生物生化鉴定系统进行生化鉴定。

1.3.2 实时荧光PCR法检测克罗诺杆菌

参照SN/T 1632.3-2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法第3部分：荧光PCR方法》的检测方法进行。取2.1中的增菌液用于细菌基因组的提取，操作按照细菌基因组提取试剂盒的操作说明进行。荧光PCR检测依据标准要求操作，根据检测样品Ct值报告阳性或阴性结果。

1.3.3 RPA法检测克罗诺杆菌

按照RRA荧光检测试剂盒说明书进行操作。反应体系为50μL，向装有干粉酶制剂的反应管中加入45.5μL反应缓冲液，再分别加入2.0μL待测DNA、阳性对照或阴性对照，在反应管盖上加入2.5μL的醋酸镁溶液，盖上管盖，上下颠倒充分混匀5～6次，低速离心10 s。RAA反应干粉酶制剂包含SSB单链结合蛋白、重组酶蛋白、DNA聚合酶、Exo核酸外切酶和辅酶等。

扩增反应程序：预热，39℃，40 s，一个循环；扩增，39℃，30 s，30个循环，收集荧光信号。

2 结果与分析

2.1 不同种类婴幼儿食品中克罗诺杆菌的污染状况

本次检测婴幼儿食品主要包括婴幼儿配方食品、较大婴儿和幼儿配方食品以及婴幼儿谷类辅助食品三大类。由表1可看出，克罗诺杆菌的总体检出率为2.68%，其中婴幼儿配方食品以及较大婴儿和幼儿配方食品的检出率为0，婴幼儿谷类辅助食品检出率为4.84%。本次婴幼儿食品中克罗诺杆菌的检出情况相比之前的国内报道，均表现在婴幼儿谷类辅助食品的检出率普遍较高，而婴幼儿配方食品以及较大婴儿和幼儿配方食品则相对稳定，检出率低，总体污染情况处于相对较低的水平[8-10]。

表1 不同种类婴幼儿食品中克罗诺杆菌的检出情况

2.2 不同检测方法在婴幼儿食品中克罗诺杆菌的检测情况

本次检测主要运用RPA方法，辅以传统培养法和实时荧光PCR法加以验证检测结果。对560份样品检测发现，3种检测方法的定性结果一致。如表2所示，在检测结果一致的前提下，对比3种检测方法发现，RPA方法大大提高了检测效率，虽然鉴于检测原理是核酸扩增，会出现假阳性的结果，但对于样品初筛可以提供很大的便利性。

表2 3种检测方法的比较

3 结 论

本研究确定了RPA方法检测婴幼儿食品中克罗诺杆菌的可行性及准确性，与传统培养法和实时荧光PCR法获得一致的结果。与上述两种方法相比较，RPA法体现出了在检测效率方面的优越性，适于样品初筛和现场快速检测，有利于及时应对食品突发事件。

基于本次检测结果发现，婴幼儿配方食品以及较大婴儿和幼儿配方食品克罗诺杆菌未检出，而婴幼儿谷类辅助食品则检出率较高。有研究显示，淀粉成分相比其他配方成分更容易引起克罗诺杆菌的污染[11]，因此，以淀粉原料为主的谷类辅食更容易受到该菌的污染。目前国家标准中对较大婴儿和幼儿配方食品和婴幼儿谷类辅助食品中克罗诺杆菌未规定限量标准，结合该类产品的食用方法及污染情况，对婴幼儿的健康会产生潜在的危害。国外曾有报道由于该类产品污染克罗诺杆菌引起较大婴儿发病的案例[8]，基于此，食品安全监管部门应考虑将该类产品纳入风险监测的范围，保障特殊人群的食用安全。