膜辅助蛋白CD46 rs1970530遗传变异对肝癌发病风险的影响

徐珊珊，宋琴琴，仵红娇，付 宁，车玲玉，金 敏，刘 冲，韩素桂，张雪梅，张 志

1.华北理工大学附属唐山市工人医院肿瘤科，河北 唐山 063000；2.华北理工大学生命科学学院，河北 唐山 063210；3.华北理工大学附属唐山市人民医院核医学检验科，河北 唐山 063000

中国是癌症高发国家，全球约22%的新发癌症病例出现在中国，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）发病率居全国第4位，严重威胁居民健康［1］。HCC可归因于生活方式与环境致癌因素和遗传因素之间复杂的相互作用［2］。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）通过改变基因结构或表达量影响基因对机体的调控，目前已确认SNP与HCC的发病风险密切相关［3-4］。深入研究HCC的发生、发展机制，对于HCC防控具有重要意义。膜辅助蛋白CD46通过血清因子Ⅰ使补体成分C3b和C4b裂解失活，保护宿主细胞免受补体依赖的细胞毒性（complement-dependent cytotoxicity，CDC）作用［5］。研究［6］发现，HCC HBx通过激活一系列信号转导通路上调CD46致HCC细胞免于CDC，表明CD46可能作为HCC患者的潜在分子标志物。Bresin等［7］研究发现，CD46基因多态性与非典型溶血性尿毒症综合征有关。目前关于CD46基因启动子区遗传变异与恶性肿瘤易感性关联的研究甚少，因此本研究探讨CD46基因多态性对HCC发病风险的影响，为HCC的早期筛查及免疫治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 基因表达谱交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）数据库

GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）在线网站是一肿瘤表达谱数据的交互式web服务器，能提供肿瘤和正常组织的差异表达分析及生存分析等多种分析模块，包含33种癌症类型的9 736个肿瘤组织样本和8 587个正常组织样本［8］。利用GEPIA对CD46在HCC癌组织及癌旁组织中的表达进行分析。

1.2 研究对象

选取2011—2015年在华北理工大学附属唐山市工人医院和华北理工大学附属唐山市人民医院经病理学检查确诊且未经放化疗的HCC患者240例作为病例组，对照组为同时期入院体检的健康人群500名。所有研究对象均无血缘关系。以查阅病历资料和问卷调查的方法收集研究对象一般人口学资料及临床资料，全部研究对象均签署知情同意书。本研究获得华北理工大学伦理委员会批准（20190321）。

1.3 SNP位点选择

通过生物信息学方法对Ensembl数据库中CD46基因启动子区SNP进行数据挖掘，筛选出影响基因转录翻译功能区域内的SNP，且所筛选的SNP在中国人群次要等位基因频率（minor allele frequency，MAF）大于0.05。最终筛选出的CD46 rs1970530遗传变异可影响CD46转录活性。

1.4 DNA提取和基因分型

收集研究对象的外周静脉血2 m L，采用天根生化科技（北京）有限公司提供的DNA提取试剂盒（DP318）提取DNA。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）法进行CD46 rs1970530 A＞G基因分型。上游引物为5’-TTCTATGAACAAACAGCCCT-3’，下游引物为5’-TCTGGCAGTTACCTTTGTGTG-3’。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性40 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；再72 ℃延伸3 min。得到341 bp的PCR产物。将PCR产物在10 μL体系中进行酶切，置于65 ℃水浴过夜。采用2%的琼脂凝胶电泳进行酶切产物分析，根据片段大小进行基因分型。

1.5 统计学处理

本研究中所有变量均采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析。采用χ2检验比较病例组和对照组中性别、年龄和吸烟状况的分布差异。由于对照组年龄中位数为60岁，故以60岁为界分为两组。采用非条件logistic回归模型分析以OR及其95% CI来表示CD46 rs1970530变异与HCC发病相对危险度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD46在HCC组织中表达显著上调

应用GEPIA工具对CD46在HCC组织（369例）和癌旁组织（50例）中的表达进行差异分析，CD46在HCC组织中的表达较正常组织显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05，图1）。

2.2 基线临床资料

选取入组的基线临床资料见表1。HCC组共纳入240例患者，男性188例，女性52例，高年龄组（＞60岁）102例，低年龄组（≤60岁）138例；对照组共纳入500名健康体检者，男性374例，女性126例，高年龄组（＞60岁）220例，低年龄组（≤60岁）280例。结果显示，病例组与对照组中年龄、性别及吸烟状况差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.3 CD46 rs1970530遗传变异与HCC发病风险

图1 CD46在GEPIA数据库HCC组织及对照组织中的差异表达Fig.1 The levels of CD46 in HCC and control tissues from GEPIA database were shown in the box plot image

CD46 rs1970530基因型在HCC组及对照组中均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），具有群体代表性。结果显示，CD46 rs1970530 A＞G多态性分布与HCC的发病风险有关。以AA基因型为参照，至少携带一个G等位基因者发生HCC的风险显著降低（OR=0.666，95% CI：0.448～0.990，P＜0.05）；以A等位基因为参照，携带G等位基因者发生HCC的风险显著降低（OR=0.689，95% CI：0.478～0.994，P＜0.05，表2）。

表1 研究对象的基本人口学特征Tab.1 Basic demographic characteristics of the study subjects

表2 基因型分布和等位基因频率分布及显性模式下对发病风险的预测Tab.2 Genotype distribution and allele frequency distribution and prediction of risk of onset in dominant mode

2.4 CD46 rs1970530 A＞G遗传变异与HCC发病风险的分层分析

分层结果见表3，按年龄分层分析，高年龄组（＞60岁）中，CD46 rs1970530与HCC易感性有显著关联，至少携带一个G等位基因者较AA基因型携带者患HCC的风险显著降低（OR=0.789，95% CI：0.298～0.995，P＜0.05）。经性别分层分析后，至少携带一个G等位基因者患HCC的风险低于AA基因型携带者（OR=0.596，95% CI：0.381～0.931，P＜0.05）。在女性、低年龄组（≤60岁）中差异无统计学意义（P＞0.05）。吸烟状态分层结果未发现CD46 rs1970530变异与HCC易感性有明显关联（P＞0.05）。

表3 CD46 rs1970530A＞G与HCC发病风险的分层分析Tab.3 Stratification analysis of CD46 rs1970530A＞G and the risk of HCC

3 讨 论

膜结合型补体调节蛋白（membrane-bound complement regulatory protein，mCRP）是在补体系统中发挥调节功能的一种负反馈因子，其作用在于避免补体系统过度激活。CD46作为mCRP家族中的重要一员，其高表达可抑制补体系统对肿瘤细胞的监测，导致肿瘤细胞免疫逃逸，也可通过直接抑制γδ T细胞分泌的干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，T N F-α），形成有利于肿瘤的微环境［9-10］。过表达的CD46已被证实与人类多种恶性肿瘤的发生、发展具有相关性，包括乳腺癌、结肠癌和多发性骨髓瘤等［11-13］。本研究通过GEPIA数据库分析得出，在HCC组织中CD46表达上调，这与之前Lu等［14］的研究结果一致，他们发现CD46在HCC患者血清中表达增加，表明CD46的异常表达可能在HCC的发生、发展过程中发挥重要作用。考虑到CD46在HCC中发挥的功能，我们测定CD46 rs1970530在HCC组及对照组中的基因型，结果显示，CD46 rs1970530基因分布与HCC的发病风险有关，至少携带一个G等位基因者患HCC的发病风险降低，目前尚未见其他CD46 rs1970530与恶性肿瘤易感性的研究报道。本课题组通过分析软件TRANSFAC预测发现，CD46 rs1970530A＞G多态性影响转录因子Oct-1、NF-1、MCM1、SRF及Sp1的结合，我们推测CD46 SNP影响转录因子结合上调CD46的表达导致肿瘤细胞免疫逃逸。经性别分层分析后，发现至少携带一个G等位基因者与男性HCC的发病风险有关，而与女性HCC无关，这种性别差异可能是体脂成分及性激素水平不同所引起［15］。在年龄分层分析中，至少携带一个G等位基因者在高年龄组与HCC的发病风险相关，提示高龄和CD46 rs1970530变异可能共同影响HCC的易感性。一项Meta分析［16］显示，吸烟者患HCC的风险是非吸烟者的1.6倍，但本研究并未发现吸烟与CD46 rs1970530遗传变异的关系，可能与所选研究对象的样本量较小有关。

另外，还有一些基因遗传变异与HCC的发病风险有关。Wang等［17］研究发现，携带rs2494752 GG基因型的个体HCC患病风险增加。高慧等［18］研究发现，TNFSF15-358T＞C遗传变异影响HCC易感性，CC基因型携带者患HCC的风险增加。携带rs12979860 T/C的个体，肝炎病毒相关HCC的发病风险较高［19］。

综上所述，CD46 rs1970530遗传变异与HCC发病风险有关，该位点有望成为判断HCC易感性的生物标志物，从而为临床提供更多潜在预防及治疗策略。