枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其特性研究

杜汉宇，葛成菲，汪丽丽，胡烨

枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其特性研究

杜汉宇，葛成菲，汪丽丽，胡烨通信作者

（天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384）

枯草芽孢杆菌是一类好氧、产芽孢、无致病性、无荚膜、能运动的革兰阳性杆状菌，由于其优越的益生特性，常作为生态制剂直接添加到饲料中。从天津周边猪场采集到样品，分离得到供试菌编号为Y33245。通过细菌形态学、生理生化特征和16S rDNA序列测定等方法，对其进行菌株鉴定，并通过药敏试验、耐盐试验、耐胆盐试验、耐人工胃液试验、耐人工肠液等方法进一步研究其生物学特性。试验结果表明：该菌株为枯草芽孢杆菌，对多种抗菌药物表现高度敏感，在人工胃液条件下，存活率可达61.3%；在人工肠液条件下，存活率可达72.6%，具有极强的抗逆性，通过对其生物学特性研究表明，该菌具有良好的生物学特性，可为后续微生态制剂研究提供数据参考。

枯草芽孢杆菌；16S rDNA；特性；分离与鉴定

枯草芽孢杆菌（）是革兰阳性杆菌，广泛存在于自然界中，也可分布在动物体表，不具备致病性[1]。在不适合生长的条件下，可以产生孢子，以一种休眠状态存在[2]。在饲料中添加益生菌已经变得普遍，其中被我国农业部允许直接喂养的益生菌之一就是枯草芽孢杆菌[3]，常以芽孢的形式加入饲料中[4]，具有调节畜禽肠道内菌群平衡的功能[5]，可增强动物免疫力，提高生长性能[6]。张媛媛等[7]研究发现，一些枯草芽孢杆菌对肠道内许多致病菌表现出不同程度的抑制，在一定程度上抑制其生长，使肠道内形成良好的环境。菌株的纯化以及优良菌株的筛选已经成为一个重要的研究方向。本试验通过分离纯化得到芽孢杆菌，并进一步了解菌株相应的生物学特性，为后续研究提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

天津周边猪场采集健康猪咽拭子、鼻拭子、粪便。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均由天津农学院预防兽医实验室提供。

1.1.2 主要试剂

革兰氏染色试剂盒、抗菌药物药敏纸片、肠杆菌科细菌生化鉴定管、大豆肉汤（琼脂）培养基、MH培养基、猪胆盐、盐酸、氢氧化钠、生理盐水均购自北京路桥生物技术有限责任公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、16S DNA通用引物、DNA－Marker、5×Loading Buffer、2×Master Mix、DNA聚合酶等均购自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养及形态学观察

对采集的样品进行处理，将处理后的样品用涂布棒均匀涂在大豆琼脂培养基上，挑取有抑菌环的单独菌落接种于大豆肉汤培养基上，进行增菌培养，得到供试菌Y33245，对其进行革兰氏染色、镜检、观察。

1.2.2 生理生化试验

选取葡萄糖、赖氨酸、鸟氨酸、硫化氢等微量生化鉴定管，用接种针将供试菌Y33245分别接种于微量生化鉴定管中，置于37 ℃恒温箱中培养24 h，观察并记录。

1.2.3 药敏试验

选取头孢哌酮、羧苄西林、庆大霉素、丁胺卡那等常用药物纸片14种，进行药敏试验，调整供试菌Y33245浓度至108CFU/mL，取30 μL均匀涂布于MH培养基上，在培养基上放置药敏纸片，37 ℃恒温箱中培养24 h，测定抑菌环并记录结果。

1.2.4 16S rDNA鉴定

取5 μL纯菌液为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系为25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL、dNTP mix 2 μL、r酶0.5 μL、DDH2O 13 μL、C DNA模版 5 μL、引物上游引物1 μL、引物下游引物 1 μL。循环35次，退火温度为58℃。将PCR产物送苏州金唯智生物科技有限公司进行16S rDNA鉴定。

1.2.5 耐盐能力试验

配制NaCl浓度为10%、12%、14%、16%的LB培养基，同时设置对照组，分别接种10 mL供试菌Y33245，置于37 ℃恒温箱中过夜培养。每个梯度取30 μL菌液涂布于大豆琼脂平板上，置于37 ℃恒温箱中过夜培养。每个梯度重复3次。平板菌落计数，计算其存活率。

1.2.6 耐胆盐试验

将大豆肉汤培养基用猪胆盐分别配制，胆盐浓度为0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%。高压灭菌，备用。分别接种10 mL供试菌，于37 ℃恒温箱中过夜培养。每个梯度重复3次，平板菌落计数，计算其存活率。

1.2.7 耐人工胃液试验

取质量分数为10%的盐酸16.4 mL，加蒸馏水稀释，调节pH值为2.0，每100 mL溶液中加1 g胃蛋白酶，充分溶解作用，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌。将供试菌Y33245进行离心，用0.9%生理盐水洗涤两次后重新悬浮，分别接种10 mL供试菌Y33245于人工胃液中，震荡混匀，置于37 ℃摇床中，每隔0.5 h取样进行平板菌落计数，计算其存活率。

1.2.8 耐人工肠液试验

取6.8 g KH2PO4，加蒸馏水500 mL溶解，以质量分数为0.4%的NaOH溶液调节pH值至6.8，加水至1 000 mL，每100 mL溶液中加1 g胰蛋白酶，充分溶解后用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌。将10 mL供试菌Y33245加入到pH值为6.8的人工肠液中，置于37 ℃摇床中，每隔0.5 h取样进行平板菌落计数，计算其存活率。

1.2.9 体外抑菌试验

调整指示菌、试验菌的浓度至106CFU/mL。取30 μL指示菌涂在大豆琼脂培养基，取灭菌牛津杯放在培养基中间，牛津杯中加入200 μL菌液，置于37 ℃恒温箱中过夜培养，两种指示菌每种重复3次，观察结果。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌的分离纯化及镜检结果

分离得到的供试菌Y33245在大豆琼脂培养基上生长良好，菌落表面粗糙不透明，呈乳白色并带有一些黄色，有隆起（图1）。革兰氏染色呈蓝紫色阳性杆菌，菌体中有透明或淡染芽孢位于菌体中央或稍偏两侧（图2）。

图1 细菌培养结果

图2 细菌革兰染色镜检结果

2.2 生化试验结果

菌株的生化反应结果见表1。参照《伯杰细菌鉴定手册》[8]、《常见细菌系统鉴定手册》[9]，初步鉴定供试菌Y33245符合枯草芽孢杆菌的生理生化特性。

表1 Y33245菌种的生化反应结果

注：“＋”表示阳性结果，“－”表示阴性结果

2.3 药敏试验结果

药敏试验结果参考美国临床实验室标准化协会（CLSI）药敏纸片扩散法[10]，结果见表2。结果表明，供试菌Y33245对这14种药物表现出高敏，说明该菌对于临床用药有良好的敏感性，无耐药性，与贺刚等[11]研究结果相一致。

表2 Y33245药敏结果

注：“S”表示高度敏感

2.4 16S rDNA鉴定结果

对菌株进行PCR扩增后，得到大小为1 500 bp的片段，如图3，将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，结果显示该菌株与枯草芽孢杆菌同源性为99.9%，说明该菌为枯草芽孢杆菌。

图3 16S rDNA电泳结果

注：M为Maker，Y33245为菌株Y33245

2.5 耐盐能力试验结果

渗透压对益生菌的生长有很大影响，渗透压过高会使益生菌破裂死亡，所以益生菌的耐盐能力是对其进行评价的重要特性之一。试验结果表明，随着NaCl浓度的逐渐升高，供试菌Y33245生长逐渐受到抑制，存活率有所下降，但当NaCl浓度达到16%时，仍有部分细菌存活，说明该菌有较强的耐盐能力[12]，结果详见表3。

表3 耐盐能力试验结果

注：“＋＋＋”表示细菌生长较好；“＋＋”表示细菌生长良好；“＋”表示细菌生长一般，下同

2.6 耐胆盐试验结果

益生菌对胆盐的耐受程度决定其是否可在肠道生长并发挥功效。耐胆盐试验结果显示，胆盐的浓度对供试菌Y33245的生长具有一定抑制作用，本试验的供试菌Y33245在胆盐浓度为0.4%的环境中仍有高于70%的存活率。菌株对胆盐有很强的耐受力，可以在高浓度胆盐的环境中存活。与孙昊岩等[13]的研究结果一致，详见表4。

表4 耐胆盐试验结果

2.7 耐人工胃液、肠液试验结果

益生菌要发挥其特定的益生作用，在胃、肠道内保持一定的存活率是至关重要的先决条件。耐人工胃液试验结果表明，初期0.5～1.0 h，供试菌Y33245存活率明显下降，随着处理时间延长，其存活率下降速度减慢，至3.0 h供试菌Y33245存活率保持在61.0%左右。耐人工肠液试验结果表明，供试菌Y33245经1.0～2.0 h的肠液处理后，其存活率逐渐下降，3.0 h后存活率维持在72.6%，存活率高于人工胃液。以上结果表明，供试菌Y33245对胃、肠道环境具有一定程度的耐受性，详见图4。

图4 耐人工胃液、耐人工肠液试验结果

2.8 体外抑菌试验结果

本研究以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，进行抑菌性分析。结果表明，供试菌Y33245对大肠杆菌的抑菌圈直径为16.5 mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为15.0 mm，说明供试菌Y33245对大肠杆菌的抑菌效果较好，对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱，但也具有一定的抑制病原菌的作用。

3 讨论

本研究从健康猪咽拭子中分离提纯得到猪源枯草芽孢杆菌一株，对其生物学特性进一步研究，结果表明，供试菌Y33245在恶劣多变的胃、肠环境中存活率可达61%以上，温灿权等[14]认为对胃、肠道环境具有很强抗逆性的菌株更容易生长，说明该菌更具有在肠道内生长并发挥优良益生特性的潜质；另外，供试菌Y33245对常见致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长具有较好的抑制作用，与杨伟平等[15]的研究结果一致，因此，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌引起的常见疾病，如仔猪腹泻、断奶仔猪因黄白痢死亡、断奶仔猪减重等[16]，可以尝试添加供试菌Y33245的生态制剂，探索其抗菌效果，及能否减少或替代抗生素的使用。

窦茂鑫等[17]认为从动物体内提取出来的益生菌与其寄主动物保持长期的共生状态，有着特异性的相互选择关系，因此从猪体内提取到的菌种更易于在同类动物体内定植，更利于作为此类生态制剂添加到饲料中。供试菌Y33245具有优良的饲料学特性，可以考虑应用于动物饲料添加剂中，后续可以对其益生作用机理等方面做进一步研究，探讨其在动物转化率、动物免疫力等方面的性能。本研究通过优势菌株筛选等试验掌握供试菌Y33245的生物学特性及其体外抑菌活性，为微生态饲料添加剂的开发提供候选菌株。

[1] 巴翠玉，张林波，张培军，等. 2株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及特性研究[J]. 华南农业大学学报，2017，38（3）：46-51.

[2] 李明，双宝，李海涛，等. 枯草芽孢杆菌的研究与应 用[J]. 东北农业大学学报，2009，40（9）：111-114.

[3] 陈雅茜，樊溢，Saad A，等. 2株芽孢杆菌生物学特性研究及菌种鉴定[J]. 山西农业科学，2018，46（2）：175-181.

[4] 曹晓敏，林跃鑫，江胜滔. 芽孢杆菌作为微生物饲料添加剂的研究和应用[J]. 养殖技术顾问，2009（4）：146-147.

[5] 王宗伟，李法增，杨志平，等. 枯草芽孢杆菌在畜禽营养上的研究进展[J]. 中国畜牧杂志，2015，51（1）：80-83.

[6] 边连全，杜欣，刘显军，等. 枯草芽孢杆菌-菊糖合生元对断奶仔猪生长性能及体液免疫功能的影响[J]. 动物营养学报，2012，24（2）：280-284.

[7] 张媛媛，黄广明，劳晔. 益生菌枯草芽孢杆菌PB6菌株对动物肠道病原菌的抑菌谱研究[J]. 饲料研究，2014（13）：46-48.

[8] R. E.布坎南. 伯杰细菌鉴定手册[M]. 9版. 北京：科学出版社，1995.

[9] 东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001.

[10] 展天松，王彦红，许梦怡，等. 肠致病性大肠杆菌的分离鉴定和耐药性分析[J]. 黑龙江畜牧兽医，2015（2）：67-69.

[11] 贺刚，何力，谢从新，等. 草鱼肠道枯草芽孢杆菌的耐药性分析[J]. 现代农业科技，2008（22）：219-220，222.

[12] 孟军，黄丽红，刘淑英，等. 动物微生态制剂猪肠源芽孢杆菌的分离与鉴定[J]. 农业科学研究，2006（3）：40-43.

[13] 孙昊岩，蒋立文，李珊珊，等. 一株鸡源芽孢杆菌的分离鉴定和益生性研究[J]. 家禽科学，2018（1）：6-10.

[14] 温灿权，陆黎明，戴佳佳，等. 猪源枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其特性研究[J]. 江西农业大学学报，2015，37（3）：522-529.

[15] 杨伟平，彭甲银，王方圆，等. 1株藏猪源枯草芽孢杆菌BY-2的益生特性分析[J]. 中国兽医学报，2015，35（8）：1211-1216.

[16] 刘影，王春林，成廷水，等. 母猪和仔猪日粮中添加枯草芽孢杆菌对仔猪生产性能的影响[J]. 饲料工业，2010，31（18）：29-30.

[17] 窦茂鑫，赵迪，王蕾，等. 猪源枯草芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特性研究[J]. 养殖与饲料，2012（4）：11-14.

Isolation, identification, and characterization of

DU Han-yu, GE Cheng-fei, WANG Li-li, HU YeCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

is a kind of aerobic, spore-producing, non-pathogenic, non-capsular and motile Gram-positive bacilli. Due to its excellent probiotic characteristics, it is often added to feed as probiotics. Samples were collected from pigs of pig farms around Tianjin. After a process of isolation, the experimental bacteria numbered as Y33245 was studied by morphology, physiological and biochemical characteristics and identified by 16S rDNA sequence analysis. Also further experiments studied its characteristics by doing drug sensitive test, salt and cholate resistance test, artificial gastric and intestinal fluid（put the strain into the fluid）test. The final experimental results showed that this was astrain which was highly sensitive to a variety of antimicrobial agents. Its survival rate in artificial gastric and intestinal fluid reached up to 61.3% and 72.6% respectively, which showed its strongly resistant characteristic. Meanwhile its biological characteristic has been studied. All these could provide reference data for the follow-up study on microecological agents.

; 16S rDNA; characteristics；isolation and identification

1008-5394（2020）03-0053-04

10.19640/j.cnki.jtau.2020.03.012

S963

A

2019-5-13

天津市大学生创新训练计划项目（201810061182）

杜汉宇（1998-），女，本科在读，主要从事病源微生物方面的研究。E-mail：3488693226@qq.com。

胡烨（1984-），女，实验师，硕士，主要从事病源微生物方面的研究。E-mail：66251294@qq.com。

责任编辑：张爱婷