基于数据库动物实验数据评价S-亚硝基谷胱甘肽治疗鼠大脑中动脉闭塞效果

彭一帆，山院飞，芦文丽

1 天津医科大学研究生院，天津 300070；2 天津市环湖医院编辑部；3 天津市第一中心医院；4 天津医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室

脑卒中发病率、病残率和病死率均较高，已成为我国居民首位死因，亦位居全球死因第2位[1]。超早期(发病6 h内)静脉溶栓、支架取栓等再灌注治疗方法由于治疗时间窗短、存在出血性转化(HT)风险，适应证较为局限，且对脑缺血—再灌注损伤无明显疗效[2]。S-亚硝基谷胱甘肽是亚硝基化环境下的谷胱甘肽衍生物，即一氧化氮(NO)在机体内与还原型谷胱甘肽形成亚硝基化合物S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)，是一氧化氮在机体内的供体以及细胞亚硝基化的中间代谢产物，以微摩尔(μmol)浓度存在于脑组织中。大脑中动脉闭塞动物模型显示，GSNO对急性缺血性卒中具有神经保护作用，但既往关于GSNO在大脑中动脉闭塞模型中神经保护作用的研究较少，且样本量较小，虽然有描述性分析[3]，但尚缺乏确切的循证医学证据。为进一步评价GSNO对大脑中动脉闭塞模型鼠的神经保护作用, 为其下一步临床应用提供理论依据,本研究基于数据库中的动物试验数据采用Meta分析系统评价了GSNO对鼠大脑中动脉闭塞的疗效。

1 资料与方法

1.1 文献检索策略 采用“主题词+自由词”的检索策略，分别以S-Nitrosoglutathione、GSNO、stroke、middle cerebral artery occlusion、MCAO、animal disease models等英文词汇，以及S-亚硝基谷胱甘肽、GSNO、脑卒中、大脑中动脉闭塞、缺血再灌注、动物疾病模型等中文词汇为检索词，计算机检索美国国立医学图书馆生物医学信息检索系统(PubMed)、荷兰医学文摘(EMBASE/SCOPUS)、Cochrane图书馆，以及中国生物医学文献数据库(CBM)、中国知网中国知识基础设施工程(CNKI)、万方数据库等数据库发表的关于GSNO治疗大鼠或小鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型的随机对照动物实验，同时查阅纳入研究的参考文献以补充可能遗漏的相关基础研究。两名研究人员独立检索，语言限制为中、英文。检索时间为1990年1月1日～2020年3月1日。

纳入标准：随机对照动物实验；动物模型为MCAO制备的脑缺血—再灌注损伤大鼠或小鼠模型；干预措施：实验组为GSNO干预大脑中动脉闭塞损伤模型(除外预防性用药)，对照组为大脑中动脉闭塞损伤模型；结局指标：GSNO对急性缺血性卒中的疗效，包括脑梗死率、梗死灶体积、神经功能(Bederson评分，总评分0～3分，评分越高、神经功能损害越严重)。排除标准：关于GSNO作用机制的研究、临床试验、个案报道或综述；非随机对照设计的动物实验；重复发表的文献及其他重复报告的文献；数据信息少或描述不翔实且无法获取相关数据的文献；非英文和非中文文献；低质量文献[脑卒中治疗专业学术圆桌会议(Stroke Ihcrapy Academic Industry Rourdtable，STAIR)[4]评分<5分]。

1.2 文献筛选及研究数据提取 由2位相互独立的评价者根据纳入与排除标准筛选文献。首先，通过阅读文题和摘要，剔除重复、不符合纳入与排除标准的文献，对于某些部分重复发表或数据有重叠现象的文献，选取样本数最大、最近发表或信息最详细者；其次，对可能纳入的文献进一步阅读全文并交叉核对结果；最后，对存在异议的文献，通过讨论或请第3位研究者协助解决分歧。对资料存疑或资料缺失的文献，通过与作者或通信作者联系，尽可能获得确认或补充。对纳入文献提取以下数据资料：①一般资料，包括文题、作者、来自国家或地区、发表日期等。②研究特征，包括实验动物种属和模型制备、治疗方法(包括给药时间、药物剂量、给药方式)、观察时间、死亡动物数等。③结局指标，GSNO治疗后脑梗死率、梗死灶体积、神经功能(Bederson评分)。

由2位相互独立的评价者采用STAIR[4]评价所纳入的动物实验的方法学质量水平，主要包括：声明实验动物福利伦理审查；避免神经保护性麻醉药；描述温度控制，记录实验动物生命体征；纳入和排除标准；样本量；随机方法；盲法分配；分析剔除的实验动物；应用有相关合并症的实验动物；说明潜在的利益冲突和研究资助。每项条目计1分，总评分10分，评分5～10分为中高质量文献、1～4分为低质量文献。

1.3 统计学方法 采用Stata16.0统计软件。计量资料的均数差相差较大，故采用标准化均数差(SMD)为效应分析统计量，区间估计以95%CI表示，效应量的检验水准均为α=0.05。各项研究之间的异质性检验采用χ2检验，当P>0.10和I2≤50.00%，无异质性，采用固定效应模型进行合并效应分析；当P≤0.10和I2>50.00%时，存在异质性，其中I2>75.00%为高度异质性，对其进行亚组分析以确定其异质性来源，采用随机效应模型进行合并效应分析。并对Meta分析结果之稳定性进行敏感性分析。采用Egger定量分析法对所纳入文献的潜在发表偏倚进行检验，以P>0.05为不存在发表偏倚。

2 结果

共获得相关文献1 875篇(包括英文文献1 800篇、中文文献75篇)，经阅读文题和摘要，剔除重复和不符合纳入与排除标准的文献1 750篇，进一步阅读全文剔除文献118篇，最终纳入7篇文献[5～11]，共计113只实验动物(包括实验组63只、对照组50只)，均为中高质量文献(STAIR评分≥5分)。其中2项动物实验[7，8]的具体数据通过联系通信作者获得；Parent等[6]的研究采用15项感觉运动项目评价神经功能(0～160分)，通过下载补充数据(实验原始数据)将该评分换算为Bederson评分(4分评价法)。Parent等[6]的研究中皮下注射小剂量GSNO组，几乎没有GSNO在体内的持续释放，故此组未予纳入。结局指标中仅Parent等[6]的研究观察脑水肿变化，故仅予以描述性评价。所纳入文献的基本特征和质量评价见表1。

表1 所纳入7项动物实验的基本特征和质量评价

2.1 GSNO治疗鼠大脑中动脉闭塞的效果 ①脑梗死率：7项动物实验中6项(Parent等[6]研究纳入2组)[5～10]报道MCAO模型鼠经GNSO干预后的脑梗死率变化，各项研究之间存在较高的异质性(P=0.00，I2=75.13%)。进一步进行异质性分析，根据药物剂量(>0.25 mg/kg为大剂量、≤0.25 mg/kg为小剂量)进行分组并行亚组分析，小剂量组(I2=28.04%，P=0.25)、大剂量组(I2=8.94%，P=0.32)各亚组间均无异质性，各亚组内实验组与对照组模型鼠脑梗死率差异均无统计学意义(小剂量组：SMD=-2.65，95%CI：-3.38～-1.91，P=0.32；大剂量组：SMD=-0.81，95%CI：-1.51～-0.11，P=0.25)。②神经功能：7项(Parent等[6]研究纳入2组)动物实验[5～11]均报道MCAO模型鼠经GNSO干预后的神经功能(Bederson评分)变化，各项研究之间存在轻度异质性(P=0.00，I2=55.12%)，故采用随机效应模型进行合并效应分析。结果显示，实验组模型鼠Bederson评分(Bederson评分，总评分0～3分，评分越高神经功能损害越严重)低于对照组且差异有统计学意义(SMD=-1.58，95%CI：-2.23～-0.93，P=0.00)。③梗死灶体积：7项动物实验中4项(Parent等[6]研究纳入2组)[6,7，10,11]报道MCAO模型鼠经GNSO干预后的梗死灶体积变化，各项研究之间存在高度异质性(P=0.00，I2=97.97%)。进一步进行异质性分析，由于Khan等[11]于2005年发表的研究梗死灶体积为最极端结果，予以剔除。根据给药方式(静脉滴注组和其他方式组)进行分组并行亚组分析，静脉滴注组(I2=0.00%，P=0.82)、其他方式组(I2=0.00%，P=0.49)各亚组间均无异质性，各亚组内实验组与对照组模型鼠梗死灶体积差异无统计学意义(静脉滴注：SMD=-6.35，95%CI：-7.9～4.8，P=0.82；其他方式：SMD=-0.66，95%CI：-1.36～0.04，P=0.49)。

敏感性分析结果显示，逐项剔除脑梗死率和神经功能评分的各项研究并合并效应分析，新的合并结果与未排除前的合并结果无明显变化，研究结论一致。

2.2 发表偏倚 对所纳入的文献进行发表偏倚分析，Egger定量分析提示存在一定的发表偏倚(P=0.00)。进一步进行剪补法校正分析，剪补前后合并效应量上述四项指标的估计值变化不明显(剪补前效应量值：-1.396，95%CI：-2.076～-0.716；剪补后效应量值：-1.234，95%CI：-1.940～-0.527)。

3 讨论

脑卒中发病急骤，干预措施限制条件较多，病残率和病死率较高，因此，探寻可以有效改善患者预后的治疗方法一直是临床研究的热点。1986 年Koizumi等首先报道了利用线栓法制备MCAO模型，经过多次改进，目前已经是比较成熟的局灶性脑缺血模型，可较完美模拟缺血性脑卒中疾病。

本Meta分析显示GSNO干预MCAO模型的脑梗死率，各项研究之间的异质性较高(I2=75.13%)，进一步行亚组分析，药物剂量可能为异质性来源，结果显示，无论小剂量组或大剂量组皆未明显降低MCAO模型鼠梗死率。且有研究显示，大剂量GSNO可以引起血压降低，但未发生致死性不良反应[12]。本Meta分析有4项动物实验报道MCAO模型鼠经GNSO干预后的梗死灶体积变化，结果显示各项研究之间异质性较高(I2=97.97%)。进一步分析，首先剔除最极端研究结果，Khan等[11]于2005年发表的研究其梗死灶体积评估方式相较近年来发表的研究精确性较低(现主要采用计算机辅助图像分析软件评估梗死灶体积)。予以剔除后，静脉滴注组(P=0.82，I2=0.00%)和其他方式组(P=0.49，I2=0.00%)的异质性明显降低，实验组与对照组梗死灶体积无明显差异，给药方式可能为脑梗死灶体积评估的异质性来源，无论采用何种给药方式，GNSO均无法降低MCAO模型的梗死灶体积。由此可见，急性缺血性卒中后的近期损伤不能通过GSNO干预而缓解，故应采取综合治疗。

本Meta分析还证实在动物实验中GSNO可以有效改善MCAO模型的神经功能(Bederson评分)(SMD=-1.58，95%CI：-2.23～-0.93；P=0.00)。敏感性分析将7项动物实验逐项排除后，重新对脑梗死率和神经功能(Bederson评分)进行合并效应分析，新的合并结果与未排除前的合并结果无明显变化，研究结论一致，表明Meta分析结果稳定。这也与GSNO的作用机制相契合，其主要是促进神经功能的恢复。

本Meta分析存在一定的发表偏倚(Egger定量分析：P<0．05)，究其原因，与GSNO治疗急性缺血性卒中的动物实验较少、小样本研究和阴性结果研究较少见有关。经剪补法校正分析，剪补前后合并效应量估计值变化不明显，说明发表偏倚影响不大，结论比较稳健。

GSNO系有氧条件下NO与谷胱甘肽反应产生的人体天然产物，存在于脑组织及其他器官中，在缺血性卒中的作用机制目前尚未阐明。GSNO半衰期为4～6 h，具有脂溶性，可以透过血-脑脊液屏障进入细胞内释放一氧化碳(CO)，调节血小板功能以改善血流动力学，减少白细胞黏附以维持脑血流量[13]。在脑缺血恢复期，GSNO刺激神经再生因子生成，通过不同靶点减轻脑缺血—再灌注损伤，减缓脑缺血致脑组织损伤的细胞变化过程，神经保护剂可以抑制血管神经单位炎症反应和氧化应激，以减轻脑缺血—再灌注损伤。亦有研究显示，脑缺血后神经保护治疗可以显著延长静脉溶栓治疗时间窗[14]，这对急性缺血性卒中的治疗意义重大。此外，外源性予以GSNO还对颅脑创伤和认知功能障碍也有积极的治疗作用；还可以防止心肌缺血性损伤，在心血管病的治疗中也表现出积极作用。

综上所述，GSNO可有效改善MCAO鼠的神经功能，有望成为改善缺血性卒中后症状的候选药物。GSNO价格低廉，易于获得，且外源性给药无明显不良反应。但本研究尚存一定的局限性：各项研究的动物样本量较小；各项研究的GSNO剂量、给药方式、给药时间不一致；GSNO制剂不统一、构造特殊，是相对不稳定的化合物，其代谢受光、温度、金属和酶等多种因素的影响；各项研究脑梗死率和梗死灶体积的评估方式无统一标准，脑梗死的评价难以达到绝对定量化，神经功能的评价方式简单、准确性较差；脑卒中多发生于老年人，特别是合并高血压、冠心病、糖尿病、高脂血症的人群，但是动物模型显然不能实现老年人及其具有合并症的要求；目前尚缺乏GSNO长期应用的研究结论。