正交试验优选酒炙牛樟芝的炮制工艺

杨义雄，梁 霜，魏文增，周春权，王 瑾，王 宫

（1.福建省中医药科学院，福建 福州 350003；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

牛樟芝（Antrodia cinnamomea）为台湾特有的多孔菌科薄孔菌属珍贵药用真菌，又名牛樟菇、樟菇、樟芝、红樟芝［1-2］。牛樟芝子实体含有大量多糖、三萜和甾醇等［3-6］，具有保肝、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、调节免疫等多种功效［7-10］，市场需求量极大，加之生长缓慢，价格昂贵［11］。牛樟芝性寒味苦［12］，长期服用易损伤脾胃［13］。为缓和其寒性，减轻副作用，增加有效成分溶出度，本研究拟通过传统的炮制技术，用酒进行炮制，采用正交试验设计，以总三萜、粗多糖含量为指标，筛选牛樟芝的最佳酒炙工艺，为牛樟芝的炮制工艺及质量控制提供依据。

1 仪器与材料

1.1仪器 751型紫外-可见分光光度计（上海分析仪器厂）；ACS-DⅡ三峰牌温控茶叶电砂锅（杭州富阳区银湖街道康泉五金经营部）；AR2140 电子天平（上海奥豪斯国际贸易有限公司）；RT-04 小型高速粉碎机（北京燕山正德机械设备有限公司）；DZF-6051 真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；KQ5200B超声仪（昆山超声仪器有限公司）。

1.2材料 实验用牛樟芝子实体（湿）购于漳州帝宝牛樟芝生物科技股份有限公司，经鉴定为椴木牛樟芝的子实体。炮制用酒:市售古越龙山陈年五年绍兴花雕酒（酒精度≥15.0%）；D-无水葡萄糖（中国食品药品检定研究院，批号110833-201506）；齐墩果酸（中国食品药品检定研究院，批号110709-201607）；水为蒸馏水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1酒炙牛樟芝的制备 将牛樟芝剪碎后60.0 ℃烘干，称重。根据酒炙的主要影响因素并结合相关文献报道［14-15］，以黄酒为辅料，采用L9（34）正交试验法对牛樟芝酒制过程中黄酒用量、炮制温度和炮制时间进行考察（因素水平见表1）。称取9 份干燥后的椴木牛樟芝，每份5 g，按表2正交试验方案分别加入不同比例的黄酒（先按比例量取黄酒，再加蒸馏水至10 ml）拌匀，闷润3 h 至黄酒被吸尽，置于电砂锅内，不同温度下炒制不同的时间，晾凉冷却，粉碎成粗粉备用。

表1 正交因素水平表

2.2总三萜含量的测定［16］

2.2.1齐墩果酸对照品溶液的配制 精密称取一定量齐墩果酸对照品，加甲醇溶解，摇匀，制成浓度为0.132 mg/ml的齐墩果酸对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 取按正交试验方案提取得到的9份酒炙牛樟芝粗粉样品适量，采用索式提取4 h后，转移提取液至100 ml容量瓶中，定容，备用。

2.2.3标准曲线的制备 取齐墩果酸对照品溶液0 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.3 ml、0.4 ml、0.5 ml、0.6 ml，分别置于具塞试管中，挥干后，加入5%香草醛-冰醋酸0.2 ml、高氯酸0.8 ml，立即摇匀，于70 ℃水浴加热15 min 后，冰浴冷却5 min，再加4 ml 乙酸乙酯摇匀。在波长546 nm 处测定吸光度。回归方程为Y=50.125X-0.003（r2=0.999 5）。表明齐墩果酸对照品溶液在0～0.016 mg/ml范围内线性关系良好。

2.2.4供试品的测定 从“2.2.2项”取一定量供试品溶液于15 ml 具塞试管中，按“2.2.3 项”操作，测定其吸光度。

2.3粗多糖含量的测定［17］

2.3.1D-无水葡萄糖对照品溶液的制备 精密称取一定量D-无水葡萄糖对照品，加蒸馏水溶解，摇匀，制成浓度为0.157 mg/ml对照品溶液。

2.3.2供试品溶液的配制 取按正交试验方案提取得到的9 份酒炙牛樟芝粗粉样品适量，每份各称取1.00 g，加适量蒸馏水浸泡0.5 h。提取3 次，每次45 min，合并滤液，浓缩至一定量，加乙醇至浓度为80%，置于冰箱12 h以上，去上清，沉淀复溶，备用。

2.3.3标准曲线的制备 取D-无水葡萄糖对照品溶液0 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml，分别置于具塞试管中，补水至2.0 ml，迅速加入0.1%-硫酸蒽酮溶液6 ml，摇匀、放置15 min，冰浴中冷却15 min。在波长625 nm处测定吸光度。回归方程为Y=30.613X+0.006（r2=0.999 4），表明D-无水葡萄糖对照品溶液在0～0.024 mg/ml范围内线性关系良好。

2.3.4供试品的测定 从“2.3.2项”分别取一定量供试品溶液于15 ml 具塞试管中，按“2.3.3 项”操作，测定其吸光度。

2.4结果与分析 正交试验安排方案与结果见表2，方差分析见表3。

表2 L9（34）正交试验方案设计与结果

表3 方差分析结果

从表2结果可知，各因素影响主次顺序为:A（黄酒用量）＞B（炮制时间）＞C（炮制温度），其中A3＞A2＞A1，B3＞B1＞B2，C3＞C1＞C2。表3 方差分析结果显示，因素A、B 对试验结果有显著性影响，C 因素无明显差异；因B1与B3相差不大，考虑到黄酒的挥发性不宜炒制时间长，因此，筛选牛樟芝的最佳酒炙工艺为A3B1C3，即5 g牛樟芝使用的黄酒比例为30%（1.5 g），考虑牛樟芝吸水性强，为使黄酒能均匀湿润药材，称取的黄酒先加蒸馏水至10 ml，再将其均匀喷洒在5 g椴木牛樟芝药材上。闷3 h至黄酒被吸尽后，置茶叶电砂锅内，150 ℃下炒制10 min，取出。60 ℃烘干至原重量（5 g），粉碎过3 号筛得牛樟芝粉末。

2.5验证实验 称取3 份牛樟芝，每份5 g，分别加入稀释后的黄酒（1.5 g 黄酒+蒸馏水至10 ml）拌匀，闷润至黄酒被吸尽，150 ℃下炒制10 min，60 ℃烘干至原重量（5 g），粉碎过3 号筛得牛樟芝粉末。此炮制条件下，测定总三萜和粗多糖含量分别为6.42%、5.10%，6.28%、5.28%，6.56%、5.33%，平均含量为6.42%、5.24%，高于正交试验中的最高值。通过验证实验结果可以看出，优选的酒炙牛樟芝炮制工艺稳定可行。

3 讨 论

酒制法是中药炮制方法中较常用的一种，其辅料分白酒和黄酒。黄酒味甘、辛，性大热，能升能散、宣行药势，具祛风散寒、活血通络、矫臭去腥等作用。牛樟芝含多糖、三萜、腺苷等多种成分，有防癌抗癌、保肝护肝等功效。由于肿瘤、肝病等患者本身正气虚弱，牛樟芝效果虽好，但极其寒凉，不适于长期服用。应用中医药炮制理论对牛樟子进行酒炙，通过添加黄酒和炒制一定的时间，不仅使牛樟芝活性成分总三萜和粗多糖的溶出率增加，且可改变牛樟芝寒凉之性，减少对胃的刺激。

本研究显示，黄酒用量和炮制时间两个因素对炮制结果有显著性影响，炮制温度无明显差异。黄酒用量对结果影响最显著，可增加有效成分的溶出，这与大多数文献报道相类似。本实验称取牛樟芝每份5 g，按比例计算的黄酒用量较少，不易拌匀药物，故先加适量蒸馏水（统一加至10 ml）稀释，再将其均匀喷洒在5 g椴木牛樟芝药材上。在预试验中，黄酒闷润时间对有效成分的溶出无显著性意义，只要保证能将药材全部闷透即可。闷润时容器应加盖，以免黄酒挥发。炒制时应炒到近干，颜色加深时取出晾凉。本研究采用90 ℃、120 ℃、150 ℃进行炒制，结果最佳炒制温度为150 ℃，但因150 ℃温度较高，容易出现焦斑，影响成品外观，故翻炒速度要快。

牛樟芝的最佳酒炙工艺为:牛樟芝加30%（g/g）黄酒闷润3 h，至黄酒被吸尽后于150 ℃炒制10 min，60 ℃烘干，粉碎。验证实验表明该工艺稳定可行，易于控制，利于牛樟芝总三萜、粗多糖的溶出，可为牛樟芝的炮制工艺及质量控制提供依据。