欧洲熊蜂蜂王体重及日龄对交配的影响

（中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093）

1 引言

熊蜂（Bombus spp.）是一种重要的传粉昆虫[1]，在维持植物多样性和生态平衡方面起着极其重要的作用[2-4]。熊蜂与蜜蜂相比，个体更大，浑身带有密密的绒毛[5]，可以进行声震授粉，对于一些花冠较深的植物具有更高的授粉效率，趋光性较弱，其在温室授粉时不易发生撞棚的现象，信息交流系统不发达，能够为特殊气味的作物（例如番茄）进行授粉，较强的耐寒性和温度适应性使其可以在低温下正常工作，6℃就可以出巢，8～10℃就能够正常授粉。每年人们都利用大量蜂群为农作物、水果、药材等农作物进行授粉，尤其是温室中的番茄。对于某些设施果树，熊蜂授粉的效果也明显高于蜜蜂[6-8]。近年来熊蜂授粉在多种农作物上得到广泛应用，如番茄、茄子、辣椒、草莓、蓝莓、南瓜、中草药等[9-11]。相对人工授粉，经过熊蜂授粉的农作物，不仅在产量方面有显著提高，而且极大地改善了果实品质。随着设施农业的发展，熊蜂作为设施作物的优良传粉昆虫被广泛应用，欧洲熊蜂作为商品蜂在全球范围内使用最为广泛。在熊蜂的人工繁育中，蜂王和雄性蜂的交配是影响熊蜂成群率的重要因素之一，而熊蜂蜂王和雄性蜂性成熟等内在原因是影响交配行为的重要因素。研究影响熊蜂交配的因素，能够更好地促进熊蜂人工繁育的进程，保障熊蜂能够更好地为设施作物授粉。

熊蜂的人工繁育是进行大规模温室授粉应用的前提，1921年出版了第一部对熊蜂人工繁育进行系统研究的专著，由此展开熊蜂人工繁育的新进程，我国对熊蜂的研究应用始于1996年[12]。熊蜂的种群发育不同于蜜蜂，整个蜂群由单只越冬蜂王构建，而蜂王的成功越冬受到交配成败、食物储存及外界环境等诸多因素的影响，蜂王的交配成功与否对整个蜂群的发展有重要意义。由于大多数熊蜂的生命周期是一年一代，一般是以交配后的蜂王单独越冬，并在第二年的春天构建蜂群，而交配失败的蜂王则不能越冬，即使未交配蜂王成功越冬也无法构建蜂群[13-15]。研究表明，在一些社会性昆虫中，雌性会进行多次交配，这样可以降低昆虫种群内的亲缘关系，从而在种群遗传方面展现出一定的优势。在熊蜂中也发现有多雄交配的蜂种[16-18]，但是大多数种类的蜂王只能交配一次，如Schmid-Hempel 等研究了8种熊蜂的交配规律，发现只有眠熊蜂（B.hypnorum）蜂王存在多雄交配的现象，而其他蜂王包括欧洲地熊蜂都是单雄交配。研究表明单雄交配的熊蜂蜂王在交配成功后，雄性蜂留交配栓在蜂王体内，阻止其他雄性蜂再次和蜂王交配[19]。Inoue等研究发现在日本野生欧洲地熊蜂蜂王交配频率明显高于人工饲养的蜂王[20]。欧洲熊蜂蜂王的平均交配持续时间约为30min[14]。另外Tasei等研究了欧洲地熊蜂雄性蜂的输精管和贮精囊内精子数量和活力在羽化后13日龄会逐渐下降，因此12日龄雄性蜂和蜂王交配成功率最高[18]。在人工控制的交配环境中，欧洲熊蜂蜂王最佳交配日龄为8～9d，雄性蜂为11～12d，蜂王和雄性蜂的数量比例为1∶1.5[1,21]，此时熊蜂交配成功率最高。熊蜂蜂王和雄性蜂交配行为是影响熊蜂繁育的重要因素之一，不同熊蜂种类具有不同的交配习性，有些蜂种交配时间较短，几分钟之内完成交配，有些蜂种交配时间长达四五十分钟。研究表明，交配持续时间越长精子转移越多，在熊蜂交配过程中，交配前的潜伏时间（以蜂王进入交配笼到开始与雄性蜂交配为潜伏时间，所处阶段为潜伏期）越短，交配成功率越高。影响熊蜂交配有多种因素，外界因素包括温湿度、光照、雌雄比等，内部因素包括性成熟程度、个体发育状态、肠道菌群调节以及个体大小等。

熊蜂每年为农作物授粉带来巨大的价值，近年来熊蜂在设施农作物中授粉应用逐渐扩大，人们对熊蜂质量和数量的要求也与日俱增，此时熊蜂的人工繁育技术受到重视。目前研究显示雌雄比、密度、光照、温湿度等综合因素影响熊蜂蜂王和雄性蜂的交配。但是熊蜂日龄及体重对交配的影响研究很少，因此，本研究从蜂王日龄及体重与交配前的潜伏时间、交配持续时间和交配成功率三个方面的相关性来研究对蜂王交配造成的影响。目前研究报道关注外部因素，从熊蜂内部因素研究报道相对较少。本实验中，基于熊蜂个体发育情况，从熊蜂内部寻找影响交配行为的因素，研究熊蜂不同日龄的交配时间、潜伏时间及其交配率之间的关系，探讨影响熊蜂交配的因素，为熊蜂人工繁育过程中蜂王的筛选及商品化繁育提供一定的依据。

2 材料和方法

2.1 熊蜂样本采集

欧洲地熊蜂蜂王和雄性蜂均来源于中国农业科学院蜜蜂研究所授粉饲养室，样本取自蜂群后期。在蜂群中挑选初羽化蜂王于饲养箱中进行单独饲养，饲养温度26±1℃，相对湿度50%±5%，在黑暗环境下饲喂50%的糖水和花粉，按照出房日龄进行取样。所取样本分别为羽化后3d、4d、5d、6d和7d，每天取15只，3个重复，共计225只，雄性蜂为性成熟蜂，性成熟蜂王称量体重后进行交配试验。

2.2 交配环境的设置

设置熊蜂交配环境，控制实验温度为26±1℃，人工控制光源，交配时间控制在上午8∶00～12∶00[22]，准备规格为100cm×100cm×100cm的交配笼，材质为棉质网的面罩，骨架为不锈钢。从饲养室中取出不同熊蜂蜂群的蜂王和雄性蜂，称量蜂王体重并编号记录，交配雌雄比为1∶2[1,21]，即每次交配包括15只蜂王和30只性成熟雄性蜂。

2.3 蜂王不同交配状态下体重的称量

不同交配状态蜂王体重的测量：随机选择50只性成熟蜂王称量体重并标号，按照雌雄比1∶2和性成熟雄性蜂投于交配笼中，待交配结束后，收集成功交配和未成功交配的蜂王重新称量体重并记录，试验重复3次。

2.4 蜂王不同体重对交配行为的影响

不同体重蜂王对交配率的影响：随机选取性成熟蜂王50只进行体重称量并编号，按照蜂王体重分为Big和Small两组，将不同组别蜂王按照雌雄比1∶2与性成熟雄性蜂置于上述交配笼中观察交配情况。蜂王体重对其潜伏时间的影响：选择性成熟蜂王称量体重并编号记录，按照体重由小至大分为A、B、C、D四组，与性成熟雄性蜂按照雌雄比1∶2投入交配笼中后观察其潜伏时间。本实验在中国农业科学院蜜蜂研究所，于2019年6月～2020年1月进行。

2.5 数据分析

首先对数据进行初步整理统计，计算出不同出房日龄熊蜂蜂王在交配笼中的潜伏时间、交配时间和交配率，利用狄克逊法则删除异常值，采用SPSS统计学软件对整理数据进行单因素方差分析，选择多项式，LSD（L）、Duncan（D）。比较体重对熊蜂交配的影响程度，通过潜伏时间和交配率整理信息，最后利用GraphPad 6绘制柱形图。

3 结果与分析

3.1 蜂王日龄对交配的影响

图1 熊蜂不同出房时间交配指标

在不同出房日龄的处女王与性成熟雄性蜂交配实验中，结果表明蜂王交配率随其日龄的增长而升高，出房日龄3d交配率为24.44%，4d为28.89%，5d为40%，6d为57.78%，7d为71.11%，蜂王出房3d与4d无明显差异，4d、5d、6d、7d的交配率差异均显著（P＜0.05）。如图1所示，潜伏时间与交配率呈负相关，随交配率的逐渐升高，蜂王在交配笼中的潜伏时间逐渐缩短，从蜂王出房3d时的31.25min缩短到7d时的10.55min，差异显著（P＜0.05）。不同日龄的蜂王交配持续时间无明显差异（P＞0.05），且在30min上下波动。

3.2 蜂王体重对交配的影响

表1 不同日龄蜂王的交配特征分析

我们测量了交配成功的蜂王和交配失败蜂王的体重，实验结果表明交配成功的蜂王平均体重为0.837g，显著大于交配失败的蜂王0.702g（图2b）。同时我们对交配前后蜂王体重进行称量，发现交配失败的蜂王交配前体重比交配后减轻29.8mg，而交配成功的蜂王在交配后蜂王体重减轻26.367mg，但是差异不显著（P＞0.05），如图2a所示，此外，交配成功和交配失败的蜂王在交配后体重都有减少，但是差异不显著（P＞0.05）。

3.3 蜂王体重对潜伏时间的影响

我们发现熊蜂蜂王交配率与潜伏时间呈负相关，不同交配状态蜂王的体重具有明显差异，根据体重对蜂王分组，A组体重0.4～0.6g，B组0.6～0.8g，C组0.8～1.0g，D组1.0～1.2g，结果表明蜂王体重影响蜂王的交配率和潜伏时间。A组蜂王交配率为32.52%，和B组无显著差异，但显著低于C组（70.02%）和D组（70.09%）。同时蜂王不同体重对潜伏时间有明显影响，体重越大，潜伏时间越短，A组潜伏时间为25min，B组为14.57min，C组为11.5min，D组为7.83min，D组潜伏时间显著低于A组。

4 讨论

熊蜂的交配主要受到自身性成熟和外界环境的影响[21]，本实验中我们模拟自然界环境条件，选择不同日龄的熊蜂蜂王与性成熟雄性蜂于交配笼中进行交配。结果表明随蜂王出房日龄增加，熊蜂交配率逐渐升高。熊蜂蜂王羽化出房后，在发育过程中机体各机能趋于完善，逐渐达到性成熟，交配率随日龄增大逐渐增高，7日龄交配成功率达到最高，说明7日龄蜂王达到性成熟。

表2 蜂王交配前后体重变化

图2 交配行为和体重之间的关系

图3 不同体重熊蜂的交配率及潜伏时间

人工控制交配时间为60min，在交配笼中进行熊蜂蜂王和雄性蜂的交配。蜂王投入交配笼至开始与雄性蜂交配为蜂王的潜伏时间，蜂王进入交配笼后需要适应笼内环境并对雄性蜂释放性信息素吸引雄蜂来交配，完成其历史使命[23]。随日龄增长，蜂王潜伏时间逐渐缩短，能够尽快完成交配，熊蜂日龄越大，性激素和生殖功能趋于完善，能够在短时间内吸引雄性蜂来交配。熊蜂蜂王潜伏时间跟多种因素有关，已有研究证明雄性蜂体重越大，交配潜伏期越短[24]，自然环境下，潜伏时间越短，能够尽快完成交配。所受到的外界威胁越小，种群繁衍成功率达到最高水平，这是自然界适应环境的选择结果。

熊蜂交配持续时间在不同日龄下相对稳定，维持在30min上下，无明显差异，前人研究表明蜂王交配平均时间为30min，交配时间和雄性蜂有关，和蜂王无关[25,26]。熊蜂交配时间与雄性蜂精子的转移数量有关，交配时间的稳定能够确保精子转移量一致，保证了后代的种群数量。出房3d蜂王交配时间为28.58min，7d为29.33min，性成熟度不同的蜂王交配时间无明显差异，但交配率差异显著（P＜0.05）。同一出房时间的蜂王在个体上也存在区别，在交配中，日龄小的蜂王交配率较低，这和蜂王和雄性蜂之间的双向选择有关，雄性蜂选择发育程度高、性状优良的蜂王完成交配[23]，避免选择发育程度低的蜂王，进而保证交配时间的稳定。实验中我们发现蜂王单次交配，和Mikheyev A.S研究一致，已有研究表明，果蝇的多次交配会缩短雌性的寿命，在实验中我们发现在蜂王和雄性蜂交配停止后，继续往交配笼中补充雄性蜂会提高交配率，出现这种现象的原因是什么目前还不清楚，需要进一步的研究[27-29]。

在熊蜂交配过程中，雄性蜂会将大量精子转移至蜂王受精囊中[30]，本实验结果也表明交配成功的蜂王体重明显比交配失败的蜂王要重，差异显著（P＜0.05），这可能与交配成功蜂王受精囊中的精子有关。在交配实验中，我们可以看到蜂王和雄性蜂会进行飞翔来寻找伴侣[22]，这一过程中消耗大量体能，从而体重下降，但交配前后的体重变化无明显差异（P＞0.05），在此过程中未交配蜂王比交配蜂王选择伴侣时间更长，因此体重下降更多，但交配前后体重变化仍无明显差异。

熊蜂的体重作为熊蜂发育程度的一项指标在熊蜂饲养中经常应用[31]，熊蜂的体重越大，说明熊蜂发育程度越好。蜂王体重对熊蜂繁育过程有着重要影响，越冬前蜂王体重最小为0.6g，平均0.8g，桉树长角螟体重越大，交配成功率越高[32,33]。本实验中体重大的熊蜂交配率明显高于体重小的蜂王，证明熊蜂蜂王体重是影响熊蜂交配成功率的重要因素之一。研究表明昆虫个体大小直接决定配偶的选择性，进而影响交配成功率[34]。由于在熊蜂幼虫期吸收的营养水平不同，所以成虫在个体大小上具有一定差异，即使同一群中的熊蜂个体间也存在着差异。熊蜂通过吸收营养调节体重，促进机体发育。实施农业授粉中，熊蜂个体大小与授粉效果有关，熊蜂依靠声震授粉，个体大的熊蜂能够更好地进行田间授粉。选择个体大的蜂王进行种群繁育，能够确保熊蜂人工繁育的优良，节约人工成本，实现资源最大化。

5 结论

在人工控制交配条件下，欧洲熊蜂蜂王的交配率随其日龄的增加而不断升高，潜伏时间不断缩短，但交配时间保持平稳，无明显差异（P＞0.05）。体重对蜂王的交配有着直接的影响，蜂王体重较大会缩短其潜伏时间并提高交配率，但我们对不同交配状态蜂王（交配成功、交配失败）交配前后体重变化进行分析，结果表明两者无明显差异，在熊蜂的人工繁育中选择性成熟且体重较大的蜂王有利于熊蜂的交配。