利尿合剂的质量标准分析

陈向英 杨志华 洪美华

广东省中山市中医院药学部，广东中山 528401

利尿合剂为本医院中药自制制剂（批号文号：粤药制字Z20071008），是本院临床治疗泌尿系感染常规用药。由叶下珠、白花蛇舌草、海金沙、一点红、金砂藤、甘草等药味组成，具有清热祛湿、解毒通淋的作用，临床用于泌尿系感染、慢性肾炎、膀胱炎、肾炎水肿、下焦不利等症[1]，为了控制利尿合剂的质量，本研究采用薄层色谱法对制剂中的白花蛇舌草、叶下珠进行了定性鉴别，同时采用高效液相色谱法对制剂中甘草酸进行了含量测定，结果表明，该实验方法简便，准确，重现性好，能有效控制利尿合剂的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪；电子天平（BS224S，Sartorius）；超声波清洗剂（KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司）；薄层色谱摄影仪（Good see-I，上海科哲生化科技有限公司）；硅胶G 板（青岛海洋化工有限公司）。

1.2 试药

利尿合剂（中山市中医院制剂室提供，每瓶100ml，样品批号：20191107，20191122，20191211）；白花蛇舌草（批号：121183-201404）、叶下珠（批号：121563-201805）、熊果酸（批号：110748-201706），对照药材与对照品均购于中国药品生物制品检定所；甘草酸（日本松浦药业株式会社）。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 白花蛇舌草 取供试品利尿合剂40mL，蒸干，残渣加乙醇10mL 使溶解，作为供试品溶液。另取白花蛇舌草对照药材1g，加乙醇10mL，超声处理30min，趁热滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL 使溶解，作为对照药材溶液。再取熊果酸对照品，加乙醇制成每1mL 含0.5mg 的溶液，作为对照品溶液。阴性样品按供试品同法处理，制成阴性供试液，照薄层色谱法（中国药典一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述四种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚（30 ～ 60℃）- 苯 - 乙酸乙酯 - 冰醋酸（20 ∶ 40 ∶ 14 ∶ 1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。见图1。

图1 （T ：28℃，RH ：65%）

图2 （T ：28℃，RH ：65%）

2.1.2 叶下珠 取供试品利尿合剂20mL，加乙酸乙酯30mL 振摇提取，蒸干，残渣加甲醇1mL 使溶解，作为供试品溶液。另取叶下珠对照药材2g，加水煎煮30min，滤过，滤液浓缩至约20mL，同法制成对照药材溶液。再取阴性样品20mL，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015 年版一部附录）试验，吸取上述三种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚（30 ～60℃）-苯 - 乙酸乙酯 - 冰醋酸（20 ∶ 40 ∶ 14 ∶ 1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，对照色谱则无此斑点。并经28℃，相对湿度（RH）35%，65%，88%；8℃下RH60% 等条件下的方法学考察，均显示出稳定的结果。见图2。

3 含量测定

3.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX XDB-C18柱（4.6mm×250mm 5μm）；流动相为甲醇-0.2mol/L 醋酸铵溶液- 冰醋酸（55 ∶45 ∶1）梯度洗脱；检测波长：250nm；流速：1.00mL/min；柱温：40℃；进样量为20μL。

3.2 对照品溶液的制备

精密称取甘草酸对照品5.406mg 置于50mL 量瓶中，加50% 甲醇至刻度作为甘草酸对照品溶液储备液，称取3mL 储备液加入10mL 容量瓶，加50%甲醇稀释至刻度作为对照品溶液。

3.3 供试品溶液的制备

取利尿合剂30mL，精密加入流动相50mL，混合均匀，超声处理10min，放冷，用流动相补足溶剂量，摇匀，过滤，取滤液20mL，作为供试品溶液。

3.4 阴性对照品溶液的制备

按处方中药味除去甘草，其余药味按成方的生产工艺及供试品溶液的制备方法，作为阴性对照品溶液。

3.5 线性关系考察

精密吸取甘草酸对照品溶液储备液1、2、3、4、5mL，分别置10mL 容量瓶中，加50% 甲醇至刻度，摇匀，分别进样（采用20μL 进样环满刻度进样），按上述条件测定。计算回归方程得：Y=419503.8X-6314，r=0.9997，甘草酸在 0.2162 ～ 1.081μg 范围内，呈良好的线性关系。

3.6 稳定性考察

精密吸取同一批（20191122）供试品溶液，每间隔1h 进样测定，RSD 为0.78%，n=6，说明供试品溶液在5h 内稳定。

3.7 精密度试验

精密吸取上述供试品溶液，按照“3.1”项下色谱条件重复进样5 次，RSD 为0.48%，表明仪器精密度良好。

3.8 重现性试验

取同一批号样品（20191122）溶液5 份，按照“3.3”项下方法制备供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件进样，测得甘草酸平均含量为0.6339mg/mL，RSD 为 0.506%，n=5。

3.9 加样回收试验

精密吸取已知含量的样品（批号20191122），分别精密加入对照品0.6437mg，按照供试品溶液准备方法制备，按“3.1”项下色谱条件测定，结果平均回收率98.60%，RSD 为0.522%。见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=5）

3.10 含量测定

分别精密吸取3 批样品各3 份，按供试品溶液制备方法制备，按“3.1”项下色谱条件测定甘草酸含量。见表2。

表2 样品中甘草酸含量测定（n=3）

4 讨论

利尿合剂是本医院中药自制制剂，由叶下珠、白花蛇舌草、海金沙、一点红、金砂藤等药味组成，是泌尿系感染、慢性肾炎、膀胱炎、肾炎水肿、下焦不利等疾病治疗的常规用药。本课题前期研究表明，利尿合剂用于泌尿系感染患者104 例，临床有效率为99.04%，明显优于宁泌泰胶囊对照组的92.15%（P ＜0.05），尿急、尿频症状消失时间和尿常规检查白细胞计数、红细胞计数好转时间较对照组减少[2]。黄新凯等[3]观察利尿合剂治疗妊娠期泌尿系感染的疗效，治疗52 例治愈率为88%，疗效明显优于宁泌泰胶囊，治疗后尿路刺激征消失时间和尿细菌培养转阴数均优于宁泌泰胶囊对照组。潘佩婵等[4]应用间歇导尿+ 口服利尿合剂预防脊髓损伤所致泌尿系感染效果显著。雷素云等[1]应用利尿合剂治疗慢性肾炎、膀胱炎等泌尿系感染，临床总有效率为99.3%。临床用于治疗泌尿系统感染、慢性肾炎、膀胱炎、肾炎水肿、下焦不利有显著的疗效。本研究对利尿合剂中的主要中药材白花蛇舌草、叶下珠进行了薄层色谱鉴别研究，结果显示薄层色谱图斑点清晰，并经多温度、湿度、多种色谱板等条件考察，均显示出清晰可分的色谱图谱，方法稳定可靠，该方法可用于利尿合剂的薄层色谱鉴别[5-8]。

本品为复方制剂，甘草酸作为甘草药材及含甘草制剂的质量控制指标性成分，在此选择了甘草酸的含量测定对利尿合剂进行质量控制。参考《中国药典》2015 版一部中甘草药材项下的含量测定方法，对制剂中甘草酸进行含量测定。结果显示，白花蛇舌草、叶下珠的薄层色谱斑点清晰，阴性无干扰。甘草酸在0.2162 ～1.081μg（r=0.9997）线性范围内，呈良好的线性关系，肯定了本方法的应用价值。分析原因，本类检测方法利用固定波长对薄层展开的各斑点进行扫描图谱分析，具有更为客观准确等优势，重现性更高[9-11]，且可同时分析多个样品，并进行分离，分离效率高，且其灵敏及准确性高的优势也适用于利尿合剂的质量控制。图像易于保存，各种优势的存在肯定了其综合的临床应用效果[12-15]。综上所述，该方法适宜于该制剂中甘草酸的含量测定，色谱峰分离度高、峰型好，且阴性无干扰。