IsoFluxTM系统在乳腺癌循环肿瘤细胞检测中的应用分析

罗雨薇　张磊　邹畅　赵盼　张雅媛　周冬仙　周文斌

[摘要] 目的 探討运用IsoFluxTM系统在乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells，CTCs）检测中的临床应用价值。 方法 回顾性分析深圳市人民医院甲乳外科2015年12月～2017年5月收治的23例女性乳腺癌患者运用IsoFluxTM系统进行循环肿瘤细胞检测的临床资料，并将CTCs数量与肿块大小、TNM分期的关系进行统计学分析。 结果 23例乳腺癌患者中，可手术乳腺癌患者22例，术前使用IsoFluxTM系统全部检测到CTCs，阳性捕获率100%，每7.5 mL全血样本中CTCs数目2～4201个不等，中位数173.5个;另1例为乳腺癌术后2年出现双肺多发结节、怀疑肺转移的患者，未检测到CTCs，根据CTCs结果对其肺部结节初步排除肺转移可能。22例可手术乳腺癌患者的肿块大小和log（CTCs）显著相关，CTCs的数量与乳腺癌TNM分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）不存在显著的相关性。结论 此次将IsoFluxTM系统应用于乳腺癌CTCs检测的探索性研究初步证明，该系统敏感性高、捕获力强，是乳腺癌患者CTCs检测的一个理想选择，有助于监测乳腺癌术后的复发和转移情况。

[关键词] 乳腺癌;循环肿瘤细胞;IsoFluxTM系统;CTC簇

[中图分类号] R737.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）23-0028-06

Application analysis of IsoFluxTM system in detection of circulating tumor cells of breast cancer

LUO Yuwei1   ZHANG Lei2   ZOU Chang3   ZHAO Pan3   ZHANG Yayuan1   ZHOU Dongxian1   ZHOU Wenbin1

1.Department of Thyroid and Breast Surgery， the Second Clinical Medical College of Jinan University， Shenzhen People's Hospital， Shenzhen   518020， China; 2.Shenzhen Tsure Biotechnology Company Limited， Shenzhen   518020， China; 3.Clinical Medical Research Center， the Second Clinical Medical College of Jinan University， Shenzhen People's Hospital， Shenzhen   518020， China

[Abstract] Objective To explore the clinical application value of IsoFluxTM system in the detection of circulating tumor cells（CTCs） in breast cancer patients. Methods The clinical data of 23 female breast cancer patients whose circulating tumor cells was detected using the IsoFluxTM system in the Department of Thyroid and Breast Surgery， Shenzhen People's Hospital from December 2015 to May 2017 were retrospectively analyzed. The relationship between the number of CTCs， tumor size， and TNM stage was statistically analyzed. Results Among the 23 breast cancer patients， 22 were operable breast cancer patients. CTCs were all detected by IsoFluxTM system before operation. The positive capture rate was 100%. The number of CTCs in each 7.5 mL whole blood sample ranged from 2 to 4201， with the median of 173.5. Another case was a patient with multiple lung nodules and suspected lung metastases 2 years after breast cancer surgery. CTCs was not detected. Based on the CTCs results， we initially ruled out the possibility of lung metastases for lung nodules. The size of lump in 22 patients with operable breast cancer was significantly correlated with log（CTCs）. There was no significant correlation between the number of CTCs and the TNM stages（Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ） of breast cancer. Conclusion The exploratory study of applying the IsoFluxTM system to the detection of breast cancer CTCs initially proved that the system has high sensitivity and strong capture power， and is an ideal choice for CTCs detection of breast cancer patients， which helps to monitor the recurrence and metastases of breast cancer after surgery.

[Key words] Breast cancer; Circulating tumor cells; IsoFluxTM system; CTC cluster

原发实体恶性肿瘤可持续释放肿瘤细胞进入血液循环，扩散到其他组织并引发转移，此过程在血液中可以检测到循环肿瘤细胞（Circulation tumor cells，CTCs）[1-2]。CTCs不仅与肿瘤转移密切相关，而且是无进展生存期（PFS）、总生存期（OS）的一个独立预后因子[3-4]。2015年12月～2017年5月，我们运用IsoFluxTM系统对我科收治的23例乳腺癌患者进行了CTCs检测，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年12月～2017年5月深圳市人民医院的23例乳腺癌患者作为研究对象。该研究得到了深圳市人民医院研究伦理委员会批准，并获得每个参与者的知情同意，签署知情同意书。可手术的乳腺癌患者22例，年龄23～64岁，中位年龄41.5岁。所有患者均经临床病理证实为乳腺浸润性癌，根据AJCC第8版[5]乳腺癌分期系统对其分为Ⅰ～Ⅲ期（其中Ⅰ期7例，Ⅱ期10例，Ⅲ期5例）。纳入标准：（1）经空芯针穿刺活组织检查确诊为乳腺浸润性癌者;（2）就诊前未接受任何辅助性治疗者;（3）无其他部位恶性肿瘤病史者。排除标准：（1）乳腺原位癌者;（2）患者入院前已行肿块切除活组织检查者;（3）既往有其他恶性肿瘤病史者。1例为24岁女性，2013年发现左乳7 cm大小肿物，经空芯针穿刺活组织检查确诊为三阴性乳腺癌，经阿霉素和环磷酰胺序贯多西他赛共8次新辅助化疗后，行左乳癌改良根治术。2015年常规复查发现肺部多发结节，在我院及国内多家医院就诊，均不能确定肺部病变性质。

图1   IsoFluxTM仪器设备

1.2 方法

用EDTA-K2抗凝采血管（10 mL）收集乳腺癌患者的健侧上肢静脉血7.5 mL，应用常规采血法，避免上皮细胞污染;轻柔颠倒混匀，避免凝血。所有样本均在室温下储存、及时运输，在24 h内送达至深圳天烁精准医学实验室进行CTCs检测。CTCs检测采用美国Fluxion公司微流控血液稀有细胞分析技术（图1）进行CTCs富集，富集后的细胞行免疫荧光染色并采用日本尼康公司ECLIPSE Ti-E倒置电动荧光显微镜进行图像扫描和分析。在三色免疫荧光结果中细胞角蛋白（CK）阳性、白细胞共同抗原（CD45）阴性、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）阳性，且细胞核形态完整的细胞被计数为CTCs，而CK-、CD45+和DAPI+细胞被定义为白细胞。记录CTCs的数量，检测到1个CTCs计为检测阳性，并根据CTCs数量与载玻片上总细胞的比率计算纯度。所有患者CTCs均由3位资深病理医师盲法独立确定。

1.3 统计学方法

采用SPSS20.0统计学软件（IBM，Armonk，NY，USA）进行Pearson相关性分析和Kruskal-Wallis检测。通过GraphPad Prism 6.0版（GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA，USA）绘制图形。

2 结果

2.1 实验室结果

使用IsoFluxTM系统处理23例临床标本。免疫荧光染色后，代表性CTCs如封三图1所示。CK+、CD45-、DAPI+的细胞被计数为CTCs，而CK-、CD45+和DAPI+细胞被定义为白细胞（封三图2）。在计数过程中观察到CTCs簇（Circulating tumor cells cluster），即两个及以上CTCs聚集成的细胞团（封三图3）。计算每个样本的CTCs数目总细胞量，结果显示在表1中。

2.2 循环肿瘤细胞检测情况分析

除P23外，拟手术的乳腺癌患者共22例（表1 P1～P22），中位年龄为41.5岁（23～64岁），77.3%（17/22）的患者肿瘤大小≥2 cm，68.2%（15/22）为Ⅱ或Ⅲ期肿瘤，50.0%（11/22）为淋巴结阳性。90.9%（20/22）属于浸润性非特殊类型，9.1%（2/22）为其他亚型。在术前使用IsoFluxTM系统全部检测到CTCs，阳性捕获率100%。每7.5 mL全血中CTCs数目2～4201个不等，中位数173.5个;检出循环肿瘤细胞共计15 165个，平均689.3个。95.5%（21/22）检查到每7.5 mL全血中5个以上CTCs细胞计数。检出CTCs数量占总细胞百分比在0.0%～34.5%之间，平均值为6.0%。1例为乳腺癌术后2年出现肺部结节的患者，肺部CT平扫如图2～4;CTCs检查报告见图5，未检测到CTCs。

2.3 CTCs数目与肿物大小的关系分析

CTCs數目与肿物大小的关系将23号患者（CTCs=0）排除，X轴为肿物大小（cm），Y轴为CTCs数目，作出CTCs数目与肿物大小散点图（图6）。再将CTCs数量做以e为底的对数转换（log转换），作CTCs数量与肿块大小的Pearson分析。肿块大小和log（CTCs）显著相关（图7），X轴为肿物大小（cm），Y轴为log（CTCs），皮尔逊相关系数为-0.49。

2.4 CTCs数目与TNM分期的关系分析

CTCs数目与TNM分期的关系 根据Kruskal-Wallis检测，CTCs的数量与乳腺癌TNM分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）之间不存在显著的相关性。

3 讨论

循环肿瘤细胞（CTCs）是来源于实体肿瘤并在血流中循环的罕见细胞。CTCs在19世纪就已经为人所知，但直到最近现代技术的发展才使CTCs的有效捕获和鉴定成为可能。2004年Cristofanilli M等[4]发现，在转移性乳腺癌患者中，CTCs数目不仅与肿瘤转移密切相关，而且是无进展生存期（PFS）、总生存期（OS）的一个独立预后因子。AJCC第8版乳腺癌分期系统再次肯定了CTCs的意义，认为临床晚期乳腺癌患者外周血CTCs≥5个/7.5 mL、临床早期乳腺癌CTCs≥1个/7.5 mL提示预后不良[5]。

但如何准确检测CTCs是个临床难题。近年来，分离CTCs的技术和仪器得到了发展，但都有捕获力低下的局限性。Cellsearch系统是唯一经美国食品和药物管理局（FDA）批准的用于乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌中CTCs计数的检测方法[6]。2014年Rack B等[7]使用Cellsearch系统用于2026例Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者外周血CTCs检测，CTCs的捕获率仅21.5%（435/2026）。其中Ⅰ期患者检出率仅为0.6%（14/2026），Ⅱ期患者检出率为10.2%（206/2026），Ⅲ期患者检出率为10.5%（212/2026）。可见，Cellsearch系统在早期患者检出率低，在检测和监控中的使用均因敏感度过低而受限。在21.5%检出CTCs阳性细胞的患者样本中，Cellsearch仅分离出少量癌细胞，检出CTCs数目为（0～827）个/30 mL，其中位数为1 个/30 mL，仅有3.1%（63/2021）患者检出大于5个/30 mL。此外，低下的富集效率和产物纯度也是该体系的缺点，给下游分析带来挑战。

IsoFluxTM是一项新型免疫磁富集仪器和微流控盒，它使用单个或多个捕获抗体（通常以EpCAM为目标），可从生物样品中分离出完整的循环肿瘤细胞（CTCs）和其他罕见细胞类型，然后通过免疫荧光染色和自动荧光显微镜扫描对采集的细胞进行分析。IsoFluxTM可提供简单、高效的细胞转移方法，使细胞从芯片转移至下一步检测的转移率高达95%。流体聚焦技术产生极高的分离效率和最低的背景，因其洗脱体积极低（<5 μL）、背景污染极小，最大限度保留了样本的完整性，为下游分析提供足够的CTCs。富集的细胞可以与下游计数、qPCR（基因表达，突变分析）、免疫表型分型（IHC，IF）、染色体畸变分析等检测方式相适应。在此过程中，CTCs检测过程大部分能由仪器自动化完成，最大程度避免手工操作导致的各种不稳定，提升实验室工作效率（其工作简化流程图见图8）。

CTCs十分罕见，仅占外周血中白细胞（WBC）的1/106～1/107，其检出十分困难。IsoFluxTM系统可降低白细胞背景，极大地减少了干扰。残留的淋巴细胞可能会干扰进一步的CTCs分析，但通过免疫细胞染色后排除CD45+细胞，可以克服细胞间视觉分析这一问题。此次研究检出CTCs数量占总细胞百分比在0.0%～34.5%之间，平均值为6.0%，远远大于外周血中CTCs在白细胞中的所占比例。另一方面，对确诊乳腺癌患者术前使用IsoFluxTM系统可全部检测到CTCs，阳性捕获率100%，每7.5 mL全血中CTCs数目2～4201不等，中位数173.5;总共检出CTCs 15 165个，平均为689.3个。95.5%（21/22）检查到每7.5 mL全血5个以上CTCs细胞计数。因此，该系统用于乳腺癌CTCs的捕获敏感性和检出数量占有明显优势。

与此同时，IsoFluxTM系统在其他类型癌症中也展现出巨大的潜力。Rao Q等[8]首次将IsoFluxTM应用于卵巢癌的研究当中，该系统从95.7%（22/23）的卵巢癌患者中检测到CTCs计数，平均数为150.6 个/7.5 mL;87.0%（20/23）检测到8个以上的CTCs计数;Alva A等[6]在膀胱癌的研究中将IsoFluxTM和Cellsearch系统进行了比较，术前将9个样本分别运用两个系统进行CTCs的检测，IsoFluxTM系统显示4个样本（44%）收集到CTCs≥10个/7.5 mL，而Cellsearch系统CTCs检出率为0（0%）。IsoFluxTM不仅提高了CTCs检测的灵敏度，而且在膀胱癌低/中/高各分类级别中体现了良好的可重复性;在60%的新辅助化疗病例和73%的转移性病例中体现了中高等水平的捕获力。在关于前列腺癌另一份研究[9]中同样将两系统进行比较，IsoFluxTM具有更好的表现。Cellsearch收获CTCs平均为（10.1±9.3），只有43%检测到5个以上的CTCs，而IsoFluxTM收获CTCs平均为（37.6±20.8），在90%的样本中都检测到超过5个CTCs，IsoFluxTM检出数量和检出率是Cellsearch的两倍;使用IsoFluxTM分离7.5 mL血液样本中的CTCs需要3 h 25 min，比Cellsearch分离CTCs共需4 h更快，这种样品制备方法的改进使得IsoFluxTM可以高效应用于临床。因此，IsoFluxTM系统在卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌中均体现了较高的临床价值。

有意思的是本组1例乳腺癌术后2年出现肺部多发结节的患者，该患者初始治疗时为22岁女性，经空芯针穿刺活组织检查确诊为三阴型乳腺癌，肿物7 cm大小，局部晚期，未发现远处转移。经新辅助化疗后行左乳癌改良根治术，术后2年出现肺部多发结节（图2～4）。当时患者曾往返国内多家大医院都不能确定或排除肺轉移，而患者当时急于结婚生育，笔者决定给她加做一项CTCs检测，最后报告显示CTCs数目为0（如图5）。笔者分析：之前检测的22例I～III期可手术乳腺癌患者，CTCs检出率为100%，假设该患者肺部结节为乳腺癌转移结节，则病情已进展到IV期，必定能检测出CTCs，但事实上该患者CTCs检出结果为0。据此推断，它的肺部结节非乳腺癌转移结节。于是她听取了笔者的意见，结婚并成功生育。在之后4年的影像学随访的过程中，未发现乳腺癌转移征象。由此可证实笔者通过CTCs检测做出的判断是准确的。

本组数据中，出现了好几例上千个甚至多达4201个CTCs的报告单，而在以往的研究中少有超过千位CTCs计数的数据。笔者曾一度怀疑该仪器检测的准确性及该阳性判断标准的可靠性。由于IsoFluxTM还未普及临床，可用于研究的临床样本量偏少，还无法从以往文献或实验中得知可能的假阳性率与假阴性率。同时不排除这几位患者已存在微转移灶而影像学及其他检查方法未检出的可能。CTCs数目值过大也可能与病理分型、ER、PR、HER-2 状态等相关。肿瘤侵袭性更强、预后更差的患者检测出CTCs数目也可能更高。因此，仍需大样本、前瞻性的临床研究来验证以上几种可能。本组怀疑乳腺癌肺转移的病例，CTCs检测为0，我们据此排除了肺转移，也从侧面证实本组CTCs检测的可靠性、准确性。

在此次觀察过程中，还发现了两个及以上CTCs聚集形成的CTCs簇（CTCs cluster）（封三图3）。有研究表明[10-14]，它的存在可缩短无进展生存期（PFS）和总生存期（OS），是一个独立的复发和死亡率指标。IsofluxTM对CTCs簇的发现更体现了它在临床检测中的应用价值。

本研究还分析了22例可手术乳腺癌 CTCs数目与患者肿物大小、临床分期的关系。结果显示肿块大小和log（CTCs）显著相关。其统计学意义为随着肿块大小的增加，CTCs数量倾向于减少，减少的幅度在肿块较小时比较大。而CTCs的数量与乳腺癌TNM分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）不存在显著的相关性。这与之前的研究结果相悖。Ma S等[15]在对187位乳腺癌患者的研究中发现，CTCs计数与TNM分期、肿瘤大小、ki-67、分子分类和内分泌治疗之间存在相关性。Kang BJ等[16]认为，CTCs数量与原发肿瘤体积呈正相关[16]。本研究分析本组统计结果的差异可能与样本量偏少有关。CTCs数目与肿块大小、TNM分期的关系还有待进一步阐明。

总之，CTCs数目不仅与肿瘤的复发和转移密切相关，而且与无进展生存期、总生存期密切相关，对指导乳腺癌的诊断、治疗及预后判断有重要意义。而 CTCs 检测技术作为一种非侵入性的肿瘤诊断方法，对患者无副作用且操作简便，更容易为患者所接受。分离富集CTCs技术具有良好的可重复性，达到实时检测疾病进展的目的。CTCs的分离和鉴定是转移性肿瘤研究中一项快速发展的技术，但是，如何准确检测到CTCs是最重要的课题。只有检测的CTCs是准确无误的，才能给治疗和监测提供重要指导;若检测有误，有可能导致诊疗决策失误。如何有效和准确地检测CTCs是当前临床都在探索的一个重要课题。此次将IsoFluxTM系统应用于乳腺癌CTCs检测进行临床研究过程中取得一些初步的成果。该系统人工操作步骤少，运行速度快，捕获率极高，在乳腺癌CTCs检测中具有美好前景，未来可能成为乳腺癌患者CTCs检测的一个理想选择。

[参考文献]

[1] Becker TM，Caixeiro NJ，Lim SH，et al. New frontiers in circulating tumor cell analysis：A reference guide for biomolecular profiling toward translational clinical use[J]. International Journal of Cancer，2014，134（11）：2523-2533.

[2] Wang C，Mu Z，Chervoneva I，et al. Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic breast cancer[J]. Breast Cancer Research and Treatment，2017，161（1）：83-94.

[3] Mego M，Mani SA，Cristofanilli M，et al. Molecular mechanisms of metastasis in breast cancer--clinical applications[J]. Nat Rev Clin Oncol，2010，7（12）：693-701.

[4] Cristofanilli M，Budd GT，Ellis MJ，et al. Circulating tumor cells，disease progression，and survival in metastatic breast cancer[J]. New England Journal of Medicine，2004， 351（8）：781-791.

[5] Hortobagyi GN，Connolly JL，DOrsi CJ，et al. AJCC cancer staging manual[J]. Breast，2017：589-636.

[6] Alva A，Friedlander T，Clark M，et al. Circulating tumor cells as potential biomarkers in bladder cancer[J]. The Journal of Urology，2015，194（3）：790-798.

[7] Rack B，Schindlbeck C，Jückstock J，et al. Circulating tumor cells predict survival in early average-to-high risk breast cancer patients[J]. Journal of the National Cancer Institute，2014，106（5）：66-76.

[8] Rao Q，Zhang Q，Zheng C，et al. Detection of circulating tumour cells in patients with epithelial ovarian cancer by a microfluidic system[J]. Int J Clin Exp Pathol，2017，10（9）：9599-9606.

[9] Xu L，Mao X，Imrali A，et al. Optimization and evaluation of a novel size based circulating tumor cell isolation system[J]. PloS One，2015，10（9）：32-54.

[10] Giuliano M，Shaikh A，Lo HC，et al. Perspective on circulating tumor cell clusters：Why it takes a village to metastasize[J]. Cancer Research，2018，78（4）：845-852.

[11] Sawabata N，Susaki Y，Nakamura T，et al. Cluster circulating tumor cells in surgical cases of lung cancer[J]. General Thoracic and Cardiovascular Surgery，2020，10（7）：1-9.

[12] Davis AA，Zhang Q，Gerratana L，et al. Association of a novel circulating tumor DNA next-generating sequencing platform with circulating tumor cells（CTCs） and CTC clusters in metastatic breast cancer[J]. Breast Cancer Research，2019，21（1）：1-8.

[13] Anna F，Malgorzata S，Anna J，et al. Circulating tumor cells in early and advanced breast cancer;Biology and prognostic value[J]. Int J Mol Sci，2020，21（5）：1671-1688.

[14] Thangavel H，Angelis CD，Vasaikar S，et al. A CTC-cluster-specific signature derived from OMICS analysis of patient-derived xenograft tumors predicts outcomes in basal-like breast cancer[J]. Journal of Clinical Medicine，2019，8（11）：1772-1786.

[15] Ma S，Ling F，Gui A，et al. Predictive value of circulating tumor cells for evaluating short-and long-term efficacy of chemotherapy for breast cancer[J]. Medical Science，Monitor：International Medical Journal of Experimental and Clinical Research，2017，7（23）：4808-4816.

[16] Kang BJ，Ra SW，Lee K，et al. Circulating tumor cell number is associated with primary tumor volume in patients with lung adenocarcinoma[J]. Tuberculosis and Respiratory Diseases，2020，83（1）：61-70.

（收稿日期：2020-05-25）