基于网络药理学探讨黄芪治疗2型糖尿病有效成分及作用机制

王庆学 吴雍真 李 倩 杜海洋 刘春艳 柴艺汇

【摘 要】 目的：探讨黄芪治疗2型糖尿病（T2DM）的有效成分及潜在靶点。方法：利用中药系统药理学分析平台数据库（TCMSP）筛选黄芪的有效成分，并收集对应的作用靶点;使用GeneCards、OMIM数据库获取T2DM相关靶点，并筛选黄芪有效成分与T2DM的交集靶点，采用Cytoscape v3.7.2软件和String数据库进行“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”及蛋白互作（PPI）网络的构建与分析;通过DAVID数据库对核心靶点进行GO注释和KEGG通路富集分析。结果：筛选出黄芪有效成分20个，与T2DM交集靶点57个。“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”网络中Degree排前5的成分为槲皮素、山萘酚、异鼠李素、刺芒柄花素、毛蕊异黄酮。GO功能注释与KEGG通路富集分析共得到116个GO注释，46条KEGG通路，按P值大小，筛选出靠前20个GO注释和KEGG富集通路。结论：结果显示黄芪治疗T2DM的主要有效成分与潜在作用机制具有多成分、多靶点、多通路等特点，为后续深入探讨其具体机制提供思路和基础。

【关键词】 网络药理;黄芪;2型糖尿病;有效成分;靶点1

【中图分类号】R285 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2020）15-0040-07

Abstract：Objective To explore the effective components and potential targets of Astragalus in the treatment of Type 2 diabetes mellitus（T2DM）.Method Screening of active ingredients in Astragalus membranaceus with TCMSP database and collection of corresponding targets. Use GeneCards and OMIM database to obtain T2DM related targets， and select intersection targets of active ingredients of Astragalus and T2DM，Cytoscape v3.7.2 software and String database were used to construct and analyze “drug-active ingredient-target protein-disease” and protein-protein interaction （PPI） network;Gene ontology（GO） annotation and KEGG pathway enrichment analysis of core targets were performed through the DAVID database. Results 20 effective components of Astragalus were screened， and 57 targets were intersected by T2DM.The top 5 components of Degree in the “Drug-Active Ingredients-Target Proteins-Disease” network are quercetin， kaempferol， isorhamnetin， formononetin，Calycosin.GO and KEGG pathway enrichment analysis obtained a total of 116 GO enrichment results， 46 KEGG signaling pathways.Conclusions The results show that the main active ingredients and potential mechanisms of astragalus treatment of T2DM have the characteristics of Multi-component，multiple targets， multiple pathways， etc.， which provides ideas and foundation for further discussion of its specific mechanism.

Keywords：Network Pharmacology;Astragalus Membranaceus;Type 2 Diabetes Mellitus;Active Ingredients;Target

2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus;T2DM）是由于胰岛素抵抗与胰岛β细胞功能失常导致碳水化合物、蛋白质、脂肪代谢异常，以高血糖为特征的代谢性疾病[1]。据统计，我国糖尿病患者数量位居世界首位，仅在2015年就约有130万人因糖尿病及其并发症死亡，且其中60岁以下占总死亡人数40.8%，呈逐渐低龄化的趋势，并且国际糖尿病联盟预测，到2040年我国将有1.51亿糖尿病患者[2]。现阶段临床上对T2DM的治疗主要为口服传统降糖药、注射胰岛素等为主，虽可一定程度控制病情，但很难从根本上治愈T2DM[3]。因此，对T2DM的防治急需研发出安全高效的新方法。T2DM归属中医“消渴”范畴，与西医相比中医重视辨证论治、内外并重，不仅疗效良好、副作用低，还可有效缓解并发症的发生，提高患者的生活质量。

中药黄芪（Astragali Radix） 已有2000多年的藥用史，始载于《神农本草经》，为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，具有补气升阳、敛疮生肌、利尿消肿、固表止汗、补益肾气等功效[4-5]。现代药理研究表明，黄芪在免疫调节、抗肿瘤、抗感染、糖尿病、心血管疾病等方面具有重要作用[6]。 通过对临床上治疗T2DM有效的中医药方剂进行收集、整理、分析发现黄芪用药频次较高，为治疗T2DM的常用药[7]。研究显示，黄芪甲苷可通过调节糖脂代谢、炎症反应、胰岛素抵抗等方面防治糖尿病[8]，同时临床观察也显示中药黄芪对T2DM的防治显示出良好的疗效[9]。黄芪防治T2DM具有多成分、多靶点等特点，故药效物质基础及作用机制难以明确。

网络药理学可多方位揭示药物治疗疾病的潜在作用机制，涉及多个学科的技术与知识。已有研究表明，利用网络药理学研究中药的作用机制符合中医药整体作用特点，方法准确可靠[10]。鉴于此，本研究利用网络药理学，筛选药物的活性成分及黄芪防治T2DM的潜在靶点，构建“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”网络，对靶点进行富集分析，探讨其潜在作用机制，为后续实验验证提供科学依据。

1 方法

1.1 筛选黄芪有效活性成分与T2DM靶蛋白 通过TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）数据库搜集黄芪的化学成分;以口服生物利用度（OB）≥30，药物相似度（DL）≥0.18为标准，筛选黄芪有效活性成分，并查询有效活性成分相对应的靶点。在GeneCards数据库（[BF]https：//www.genecards.org/）[BFQ]、OMIM数据库（https：//omim.org/）获得T2DM相关靶点。所得化合物的靶点与T2DM靶点取交集，使用Cytoscape v3.7.2软件构建药物-活性成分-靶蛋白-疾病可视化联系。

1.2 构建蛋白-蛋白互作网络 将交集得到靶点导入String数据库（https：//string-db.org/），构建蛋白质-蛋白质（PPI）互作网络。将Degree从大至小排序，以前30为标准筛选核心靶点。

1.3 GO功能富集分析和KEGG富集分析 将1.2筛选出的核心靶点导入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov），以人类为研究对象进行GO（gene ontology）注释和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，将P值设为小于0.01。其中GO分析包括生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）。

2 结果

2.1 黄芪有效成分及靶蛋白分析 通过TCMSP数据库检索关键词“黄芪”获得成分87个，通过相关条件筛选得到黄芪有效成分20个（如表1所示），并查询获得有效活性成分相对应的靶点，剔除4个未查询到靶点的活性成分，结果显示16个活性成分共对应210个靶点。在GeneCards、OMIM数据库检索关键词“Type 2 diabetes mellitus”，筛选得到相应靶点后取并集，删除重复项后获得T2DM相关靶点。将筛选获得的有效活性成分对应的靶点与T2DM相关靶点取交集，获得57个靶点分别对应13个活性成分。Degree排前5的有效活性成分为槲皮素（quercetin）、山萘酚（kaempferol）、异鼠李素（isorhamnetin）、刺芒柄花素（formononetin）、毛蕊异黄酮（Calycosin），这些可能为黄芪治疗T2DM的关键有效成分（如表2所示）。利用Cytoscape软件建立“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”网络（如图1所示）。

2.2 构建蛋白-蛋白互作网络 将重合的57个靶点导入String作PPI网络，网络共有57个节点，512条边（如图2所示），根据Degree大小排列，取前30筛选为核心靶点（如图3所示）。将核心靶点对应的有效成分与2.1所得的5个可能为黄芪治疗T2DM的有效成分取交集，结果显示交集与之前5个有效成分相同，故推测，槲皮素、山萘酚、异鼠李素、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮可能是黄芪治疗T2DM的关键有效成分。

2.3 基因功能与通路富集分析 通过DAVID数据库对黄芪治疗T2DM的30个潜在作用的核心靶点进行分析，根据P<0.01，共得到116个GO注释，46条KEGG通路。按P值大小，筛选出前20个GO注释（如图4所示），表中GO注释12个与BP有关，7个与MF有关，1个与CC有关，GO注释大多与BP和MF相关，如转录因子结合、酶结合、基因表达正调控、RNA聚合酶II启动子对转录的正调控等。

KEGG结果显示，30个核心靶点共富集在46条通路上，主要集中在癌症信号通路、乙型肝炎、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、病毒性心肌炎、低氧诱导因子（HIF-1）信号通路、人嗜T淋巴细胞病毒I型感染、军团菌病、p53信号通路、催乳素信号通路、雌激素信号通路等。P值排前20条通路（如图5所示）。

3 讨论

3.1 黄芪发挥作用的关键有效成分 近年来，众多实验及临床观察均证实黄芪对T2DM具有良好的疗效，但对其有效成分与机制尚不明确。本研究利用网络药理学，构建“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”网络，结果显示黄芪13个活性成分对应T2DM的57个靶点，并通过分析获得黄芪治疗T2DM的关键活性成分可能为槲皮素、山萘酚、异鼠李素、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮，其中，作用最强的两个化合物均被报道有明显降糖作用。槲皮素又名槲皮黄素，属于黄酮类化合物，广泛存在于植物的果实、花和叶中，具有调节血脂和血糖和清除氧自由基、抗肿瘤、抗炎等作用[11]。研究显示，槲皮素可降低T2DM模型大鼠血糖，并有效减轻其外周胰岛素抵抗，并且槲皮素也可改善被高糖抑制的神经细胞增殖活性，减少氧化应激损伤[12]。山奈酚又名百蕊草素Ⅲ，属于黄酮类化合物，具有调节免疫、抗病毒、抗氧化等功效。近年研究表明山奈酚在T2DM及并发症的防治中具有很大的应用前景。山奈酚具有保护胰岛β细胞功能、改善胰岛素抵抗、调节血糖血脂的作用，并且对T2DM的并发症也具有保护作用[13]。其余三个关键活性成分与T2DM相关报道较少，故推测这几种活性成分与T2DM的研究较少，本研究可为后期深入探讨黄芪治疗T2DM的有效成分提供理论参考。

3.2 黄芪治疗op的核心靶点 对黄芪治疗T2DM所涉及的57个靶点进行PPI网络的构建并分析，结果显示Degree排前30的靶点（图3）为血管内皮生长因子A（VEGFA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（CASP）3、白介素-6（IL-6）、表皮生长因子受体（EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）等，并推测这些靶点可能在黄芪治疗T2DM中发挥关键作用。VEGF为内皮细胞特异性有丝分裂原，具有强大的促血管形成能力和促血管通透效应，对维持微循环系统功能正常有重要作用，而VEGFA则被认为是传统意义上的VEGF。糖尿病狀态下，糖基化终末产物及各种细胞因子的增多、蛋白激酶C的活化等因素均可导致肾脏VEGF的表达升高[14]。在对T2DM全基因组关联研究发现VEGFA基因上的单核苷酸多态性位点rs9369425与T2DM存在相关性[15]。IL-6是一种多功能细胞因子，在免疫、炎症中起关键调节作用。T2DM患者长期处于低度炎症的状态下，IL-6多存在异常升高。研究显示，黄芪多糖可调节T2DM大鼠IL-6水平，保护胰岛β细胞，改善机体糖代谢状态[16]。MAPK信号转导通路是哺乳动物细胞内介导细胞反应的重要信号系统，普遍存在于多种生物。MAPK与T2DM关系密切，MAPK的激活可促进外周胰岛素抵抗，抑制胰岛素的合成与分泌，增加胰岛细胞的凋亡。

3.3 主要富集通路 GO功能富集分析结果显示，黄芪可能在转录因子结合、酶结合、基因表达正调控、RNA聚合酶II启动子对转录的正调控等过程中起作用，发挥起防治T2DM的功效。KEGG通路富集分析结果显示黄芪可能调控癌症信号通路、乙型肝炎、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、病毒性心肌炎、低氧诱导因子（HIF-1）信号通路、人嗜T淋巴细胞病毒I型感染、军团菌病、p53信号通路、催乳素信号通路、雌激素信号通路等防治T2DM。这些通路都较为复杂，包括多个下游通路。例如显著性最高的癌症信号通路包括、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路等[17]。PPAR是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员，具有多种生物学效应。研究显示，PPAR在T2DM中具有重要作用，其可增强机体对胰岛素的敏感性、调节体内糖代谢平衡等[18]。Wnt信号通路是调控器官生长和分化的重要通路之一，与肿瘤的发生发展相关。Wnt信号通路在糖尿病发生发展中的作用已受到广泛关注，也有研究证实，Wnt信号通路多个组成成分参与胰岛β细胞的增殖、葡萄糖诱导的胰岛素分泌等[19]。MAPK是一组细胞内广泛分布的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其可磷酸化靶蛋白来调控信号通路，抑制肝脏对糖的输出、降低脂肪生成和三酰甘油合成，从而发挥能量代谢功能。并且MAPK可通过上调葡萄糖转运载体-4的表达，促进糖的吸收与利用，增加胰岛素敏感性和改善胰岛素抵抗[20]。此外，雌激素、TNF与胰岛素具有密切關系，雌激素可影响胰岛素敏感性，并且其水平降低可减弱雌激素抑制TNF释放的作用，TNF-α抑制脂肪、肌肉细胞胰岛素受体在胰岛素刺激后自体硫酸化能力，并显著降低葡萄糖转运蛋白的表达[21]。

综上所述，本研究初步验证和预测黄芪治疗T2DM的有效成分与分子机制，发现结果呈现多成分、多靶点、多通路的特性，可为后续深入研究其具体机制提供思路和基础。

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（收稿日期：2020-06-07 编辑：程鹏飞）