不同pH条件下五倍子中β-PGG水解产物分析及其含量研究

张艳娇 杨玲 向润清 黄宽 方山丹 范源 朱培芳

摘要：目的 研究并分析β-PGG、3GG、GA、PA等在不同pH磷酸盐缓冲液中的含量变化及β-PGG水解产物分析情况。方法 采用经典恒温法考察β-PGG、GA、PA在不同pH缓冲液（pH=2、3、4、5、6、7、8）中的水解情况，用RP-HPLC法在同一色谱条件下对β-PGG水解产物进行分析及含量测定。结果 在同一色谱条件下发现β-PGG分解为GA和少量3GG之外，同时考察了GA在不同缓冲溶液中的产物分析，发现GA可生成少量3GG及PGG，未见PA分解。结论 β-PGG及GA、PA在不同pH条件下的含量变化反映了不同酸碱度对β-PGG水解反应的影响;本实验也发现β-PGG可分解为GA，3GG;GA在一定的条件下会合成3GG及β-PGG。目前文献多报道β-PGG的合成，其在不同PH条件下分解的产物及产物含量变化的研究报道较少，本研究有助于了解β-PGG的化学稳定性及其分解产物的相关性，可为进一步研究β-PGG的理化特性及鞣质类中药的养护、储存、加工及临床应用提供一定参考。

关键词：β-PGG;1，3，6-Tri-O-galloylglucose;没食子酸;焦性没食子酸;pH缓冲液;水解反应

中图分类号：R285 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）08-0054-05

【Abstract】Objective： To study and analyze the content changes and β-PGG hydrolysates of β-PGG， 3GG， GA and PA in different pH phosphate buffers. Methods： The classic constant temperature method was used to investigate the hydrolysis of β-PGG， GA， and PA in different pH buffers （pH=2， 3， 4， 5， 6， 7， and 8）. The RP-HPLC method was used under the same chromatographic conditions. Results： Under the same chromatographic conditions， it was found that β-PGG was decomposed into GA and a small amount of 3GG. At the same time， the product analysis of GA in different buffer solutions was investigated and GA was found to generate a small amount of 3GG and PGG， and no PA decomposition was seen. Conclusion： The content changes of β-PGG， GA and PA under different pH conditions reflect the influence of different pH on the hydrolysis reaction of β-PGG. This experiment also find that β-PGG can be decomposed into GA and 3GG and GA under certain conditions can synthesize 3GG and β-PGG. At present， the literature mostly reports the synthesis of β-PGG， and few research reports on its decomposition products and product content changes under different pH conditions. This study helps to understand the chemical stability of β-PGG and the correlation of its decomposition products and can provide a reference for further research on the physical and chemical properties of β-PGG and the maintenance， storage， processing and clinical application of tannin Chinese medicine.

【Key words】β-PGG， 1，3，6-Tri-O-galloylglucose， gallic acid， pyrogallic acid， pH buffer， hydrolysis reaction

1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰基葡萄糖（1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose，β-PGG）属天然水解类鞣质，是单宁类中最有效的抗氧化剂之一，来自于多种药用植物，如五倍子、芍药、余甘子等。β-PGG具有广泛的生物活性和药理活性，如抗炎症、抗氧化、抗糖尿病等作用[1-4]，其能通过诱导细胞凋亡[5]、防止突变、转移和新生血管生成[6-8]。β-PGG在治疗各种癌症方面具有良好效应，包括肝癌[9-10]、乳腺癌[11]、结肠癌[12-13]、肾癌[14]和前列腺癌[15-16]等。β-PGG对癌细胞的选择性杀伤作用极其重要，它抗肿瘤和抗糖尿病等作用需要进一步探索以充分发挥其潜力，故研究β-PGG及其水解产物的化学特性及药效学特性有较为重要的意义。

β-PGG是5个没食子酸与1个葡萄糖酯化反应的产物，在该反应过程中没食子酸（gallic acid，GA）与葡萄糖上的羟基结合，逐步生成二没食子酰葡萄糖、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖和五没食子酰葡萄糖，其在pH值为5～6范围内较稳定，在pH值为7.0条件下分解[17]。β-PGG在酸、碱条件下水解过程与上述酯化过程相反，分解为1，3，6-Tri-O-galloylglucose（3GG），最终水解为GA。GA在五倍子、苏木、金缕梅、茶叶、橡树树皮和其他植物中大量存在，具有清除自由基的能力，是一种优良的抗氧化剂，具有广谱的治疗作用，包括抗肿瘤[18-19]、抗炎[20-21]、抗肥胖[22]、抗菌和抗糖尿病[23-27]等。目前其主要药用用途包括镇痛剂、收敛剂和抗菌药物，研究发现它和它的酯类衍生物可作为一种有价值的抗癌药物[28-29]。焦性没食子酸（Pyrogallol Acid，PA），又称邻苯三酚、焦醅酚、焦棓酸，是存在于许多植物果实中的天然多酚类化合物，其多应用于农药、合成医药、显影剂以及化学分析试剂等，是许多药物的有效成分和重要的抗氧化剂;GA经过化学法脱羧反应后得PA，也可利用生物法在没食子酸脱羧酶的作用下发生脱羧反应生成PA[30-31]。化学结构式见图1。

本实验将根据多酚类化合物的特性考察在同一HPLC色谱条件不同pH对β-PGG、GA分解和或合成产物及产物含量分析。

1 材料

1.1 试剂 甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、甲醇（分析纯）、磷酸（分析纯）、磷酸氢二钠（分析纯）等购自云南丹赤贸易有限公司;纯净水购自杭州娃哈哈集团有限公司。1，2，3，4，6-五-O-没食子酰葡萄糖（委托成都普瑞法科技开发公司从五倍子中提取，共2.5g，含量≥98%）成都普瑞法科技开发有限公司;1，3，6-Tri-O-galloylglucose（批号：CFN95043，含量≥98%），武汉天植生物技术有限公司;没食子酸对照品（批号：16081904，含量≥98%），四川省维克奇生物科技有限公司;焦性没食子酸对照品（批号：16052801，含量≥98%），上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器 Agilent 1200系列高效液相色谱仪（VWD 紫外检测器），美国安捷伦公司;FA1004N型1/1万电子分析天平，上海菁海仪器有限公司;YL-080ST型超声清洗机，深圳市语路清洗设备有限公司;酸度计，梅特勒-托利多仪器有限公司;数显恒温水浴锅，北京永光明医疗仪器厂。

2 方法

2.1.1 磷酸盐缓冲液的配制 A液：取磷酸10mL，加纯化水至100mL，摇匀。B液：称取磷酸氢二钠7.2g，加纯化水使溶解成100mL。分别取不同体积的A，B液用酸度計调pH值到2、3、4、5、6、7、8，分别置于50mL容量瓶中，备用。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品β-PGG 2.3mg，3GG 2.2mg，GA 3.1mg，PA 2.6mg置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 考察β-PGG、GA在pH为3、4、5、6、7、8时的缓冲液分解产物。称取β-PGG、GA对照品各2.6mg分别于12个10mL容量瓶中，超声使其溶解之后，置于60℃～65℃水浴锅上保存12h后用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得供试品溶液。

2.1.4 色谱条件 色谱柱ZORBAX SB-C18柱（4.6×250mm，5μm）;柱温25℃;检测波长280nm;流速1mL/min;进样量10μL;乙腈和0.1%磷酸梯度洗脱，洗脱程序见表1。

2.1.5 测定不同pH条件下β-PGG、GA分解和或合成产物的含量变化 使用色谱柱ZORBAX SB-C18柱（4.6×250mm，5μm），按表4色谱条件，取2.2.1对照品分别2、4、6、8、10、12、14、16μL不同体积进样，以其峰面积（Y）对其标准品的质量（X）测得β-PGG、3GG、GA、PA的线性范围如表5所示，其精密度分别为1.14、1.14、1.54、1.53%;同时测定2.2.2供试品溶液的含量变化如表6所示。

实验结果发现，同一色谱条件不同pH条件下，β-PGG可分解为3GG、GA，未见PA分解;GA也可分解，同时观察到GA在一定的pH情况下还会合成3GG、β-PGG，未见PA分解，见图3。

3 结果与讨论

3.1 实验结果 根据实验结果可知β-PGG在酸性条件下较为稳定，随着pH增大，其分解较快，结合第二部分实验，pH越大，分解生成3GG、GA的含量也增加;对于GA，酸性条件时，含量变化不大，至但随着pH增大，其降解生成3GG、β-PGG的含量随之增大，但pH为8时，未见任何化合物的生成，这可能与酸碱度对其影响较大，故迅速降解有关。

3.2 存在问题及展望 本次实验应用同一色谱条件将β-PGG、3GG、GA、PA分解出来，但是峰形还需进一步改善;其次，本实验过程发现GA在随着pH增大时，其颜色逐渐变为绿色、深绿色，在60℃加热12h后，其颜色未发生较大变化，没有考察加热对其分解的影响，之后还应改进实验设计方案。

β-PGG、GA存在于多种鞣质类中药，研究不同酸碱度对其影响有助于了解β-PGG、GA的化学稳定性、提高其生物利用度，为进一步研究β-PGG的理化性质，将其更好地用于临床及鞣质类中药的养护、储存、加工及临床应用提供一定参考依据。

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（收稿日期：2020-06-26）