灯盏乙素酰胺类衍生物的合成及抗白血病活性研究

柳丙玲，秦雪莹，曲 艺，韩 通

(黑龙江八一农垦大学 制药工程系，黑龙江 大庆 163319)

灯盏乙素，是从菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus (Vant.) Hand-Mazz的干燥全草中分离得到的一种黄酮苷类化合物[1]。现代药理研究表明，灯盏乙素具有心血管保护活性、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种药理作用[2]。临床上常作为主要有效成分，用于治疗心血管类疾病。近年来，灯盏乙素的抗肿瘤功能的研究与开发日益受到重视。研究发现，灯盏乙素可以通过多种途径来发挥抗癌作用。主要包括，灯盏乙素可以诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤转移和侵袭、逆转肿瘤细胞的耐药性和增加肿瘤对药物的敏感性等[3-6]。此外，灯盏乙素的药理毒理实验表明，灯盏乙素即使较高的给药剂量下，对动物的毒性也较低[7]。进一步表明灯盏乙素具有较好的选择性。但灯盏乙素的结构不稳定，体内易代谢，生物利用度低的问题，限制其进一步的开发[8]。科研人员尝试在其羧基部位成酯，获得了多种灯盏乙素酯类衍生物，发现这些衍生物的药代性质得到了一定的改善，但仍不是很稳定[9-10]。为了进一步提高灯盏乙素的稳定性和抗肿瘤活性，本研究拟合成灯盏乙素的酰胺类衍生物，选取多种脂肪胺，进行缩合，成酰胺键。此外，甲氧基是黄酮类天然产物中较为常见的活性基团，很多含有甲氧基的黄酮类化合物均具有较好的生物活性，因此，我们引入甲基于灯盏乙素的4'-OH和6-OH处。，综上，本研究合成了灯盏乙素酰胺类衍生物，并选取对灯盏乙素较为敏感的人白血病细胞株HL-60和THP-1，测试了目标化合物的体外抗增殖活性测试。

1 结果与讨论

1.1 合成及结构解析

本文以市售的灯盏乙素为原料，经三步化学反应，合成目标化合物4a-d。首先，以碘甲烷为甲基化试剂，于灯盏乙素结构中的4'-OH、6-OH和糖羧基位置上甲基，得到甲基化灯盏乙素中间体2。进一步经醇钠水解，脱去糖羧基上的甲基保护基，得到羧基裸露的中间体3。选取多种脂肪胺，包括丙胺、异丙胺、己胺和环己胺，在缩合剂HOBt和EDCI的条件下，与中间体3室温反应，得到目标化合物4a-d。并通过1H-NMR和HR-MS对目标化合物的结构进行确证。以化合物4a的波谱数据为例，进行分析。在1H-NMR谱中，δ12.92单峰为结构中5-OH信号；δ8.08和7.13附近出现双峰且耦合常数相同，归属为结构中B环的2'，6'和3'，5'的信号氢；δ7.04和6.97为单峰，分别归属为结构中A环8位和C环的3位上信号氢；δ5.52、5.22、5.15和3.91，表现为宽单峰或双峰，为糖上的醇羟基和糖上脂肪烃氢信号；4'和6位甲氧基的信号也很明显，分别为δ3.87和3.77的单峰；丙胺的两个亚甲基的信号为δ3.04和1.41附近的多重峰，甲基在δ0.79处显示三重峰。在高分辨质谱中，HR-MS (ESI) m/z calcd for C26H29NO11[M+Na]+554.1741，found 554.1650，表明分子量正确。综上，可以确认目标化合物结构的正确性。

1.2 衍生物4a-d的抗白血病细胞株增殖活性

选取人白血病细胞株HL-60和THP-1，采用台盼蓝染色法测试了目标化合物4a-d的体外抗肿瘤细胞株增殖活性，具体结果见表1。表中数据结果表明，灯盏乙素酰胺衍生物4a-d，对两株细胞株都具有抗增殖活性。化合物4b-d对THP-1的IC50值明显低于灯盏乙素；4b和4d对HL-60的抑制能力与灯盏乙素相当；化合物4a对两株细胞株的抑制活性均与灯盏乙素相差不大。其中化合物4c对两株细胞株的抑制能力最强，其IC50分别为4.21和5.76μM，表现出较强的抗肿瘤活性。

表1 目标化合物4a-d体外抗白血病细胞 株HL-60和THP-1增殖活性

2 结论

本文共合成了四个结构全新的灯盏乙素酰胺类衍生物4a-d，并采用台盼蓝染色法，对所合成的目标化合物进行体外抗白血病细胞株活性测试。实验结果表明灯盏乙素酰胺衍生物对HL-60和THP-1细胞株都具有一定的抗增殖作用。部分化合物对THP-1细胞株的抑制能力强于先导化合物灯盏乙素。其中化合物4c对两株细胞的抑制作用最强，并明显强于灯盏乙素。以上结果，为灯盏乙素的进一步抗肿瘤研究奠定基础。

3 实验部分

3.1 仪器与试剂

实验仪器：Bruker-ARX-300型和Bruker-AV-600型(TMS作内标)核磁共振光谱仪。日本岛津GCMS-5050A气质联用仪；Agilent 1100离子阱型液-质联用仪。

实验材料：灯盏乙素(纯度98%，南京泽朗生物科技有限公司)；柱色谱分离采用硅胶H或硅胶(200～300目)，薄层色谱用硅胶GF254，均采购于青岛海洋化工厂；其他试剂与化学原料均为化学纯或分析纯。

3.2 实验方法

3.2.1 中间体2的合成

取灯盏乙素(1.39g，3mmol)，溶于DMF(10mL)中，加入碘甲烷(1.12mL，18mmol)和DBU(2.3mL，15mmol)，室温搅拌，反应24 h后终止反应。将反应液倾入100 mL冰水混合物中，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，饱和食盐水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱色谱分离，得淡黄色固体635mg，收率41.9%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm): 12.96 (s,1H,5-OH),8.03 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-2 ,6 ),7.55 (d,2H,J = 7.0 Hz,Ar-H),7.48 (d,2H,J = 7.4 Hz,Ar-H),7.36 (m,9H,Ar-H),7.25 (d,2H,J = 7.0 Hz,Ar-H),7.20 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-3 ,5 ),7.12 (s,1H,H-8),6.95 (s,1H,H-3),5.66 (d,1H,J=5.3 Hz,H-1),5.57 (d,1H,J = 5.7 Hz,sugar hydroxyl),5.43 (d,1H,J=7.4 Hz,sugar hydroxyl),5.37 (d,1H,J = 5.3 Hz,sugar hydroxyl),5.24 (s,2H,-CH2-),5.17(d,2H,J = 11.9Hz,-CH2-),5.02 (d,2H,J = 10.9 Hz,-CH2-),4.29 (d,1H,J = 9.6 Hz,H-5 ),3.53-3.40 (m,3H,H2,3,4);MS(ESI) m/z733.2[M+H]+。

3.2.2 中间体3的合成

取化合物2(504mg，1mmol)，溶于二氯甲烷/醇溶液中(32mL),滴加甲醇钠(2～3mL)，室温反应8-12h。浓缩，加入水(10mL)，调pH值至3-5，抽滤，烘干，得黄色固体461mg，收率94.1%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm):12.94 (s,1H,5-OH),8.06 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-2 ,6 ),7.15 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-3 ,5 ),7.09 (s,1H,H-8),6.96 (s,1H,H-3),5.61 (s,1H,H-1 ),5.50 (s,1H,sugar hydroxyl),5.37 (s,1H,sugar hydroxyl),5.33 (d,1H,J = 7.0 Hz,sugar hydroxyl),4.21 (d,1H,J = 9.4 Hz,H-5 ),3.87 (s,3H,-OCH3),3.76 (s,3H,-OCH3),3.66 (s,3H,-OCH3),3.48-3.35 (m,3H,H-2 ,3 ,4 );MS(ESI) m/z: 491.1[M+H]+。

3.2.3 目标化合物4a-d的合成

取中间体3(60mg，0.12mmol)，HOBt(20mg，0.14mmol)，EDCI(46 mg，0.24mmol)溶于DMF中(2mL)，搅拌至完全溶解。加入相对应的脂肪胺(0.14mmol)，室温避光反应2h。将反应液倾入20mL冰水混合物中，用乙酸乙酯萃取(20 mL×3)，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离，得到灯盏乙素酰胺类衍生物4a-d。

目标化合物4a，黄色粉末，收率61.9%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm): 12.92 (s,1H,5-OH),8.08 (d,2H,J = 8.9 Hz,H-2 ,6 ),8.01 (t,1H,J = 5.6 Hz,-NH-),7.13 (d,2H,J = 8.9 Hz,H-3 ,5 ),7.04 (s,1H,H-8),6.97 (s,1H,H-3),5.52 (brs,1H,H-1 ),5.22 (brs,1H,sugar hydroxyl),5.15 (d,1H,J = 7.5 Hz,sugar hydroxyl),3.91 (d,1H,J = 9.7 Hz,H-5),3.87 (s,3H,-OCH3),3.77 (s,3H,-OCH3),3.52-3.42 (m,3H,H-2,3,4 ),3.04 (m,2H,-CH2-),1.41 (m,2H,-CH2-),0.79 (t,3H,J = 7.4 Hz,-CH3); HR-MS (ESI) m/z calcd for C26H29NO11[M+Na]+554.1741,found 554.1650。

目标化合物4b，黄色粉末，产率49%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm): 12.91 (s,1H,5-OH),8.09 (d,2H,J = 8.9 Hz,H-2 ,6 ),7.94 (m,1H,-NH-),7.12 (d,2H,J = 8.9 Hz,H-3 ,5 ),7.05 (s,1H,H-8),6.96 (s,1H,H-3),5.52 (brs,1H,H-1 ),5.24 (brs,1H,sugar hydroxyl),5.10 (d,1H,J = 7.6 Hz,sugar hydroxyl),3.87 (s,3H,-OCH3),3.82 (d,1H,J = 7.1 Hz,H-5 ),3.77 (s,3H,-OCH3),3.52 (m,1H,-CH-),3.39-3.37 (m,3H,H-2 ,3 ,4 ),1.08 (d,3H,J = 6.5 Hz,-CH3),1.03 (d,3H,J = 6.5 Hz,-CH3); HR-MS (ESI) m/z calcd for C26H29NO11[M+Na]+554.1741,found 554.1652。

目标化合物4c，黄色粉末，产率36%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm): 12.91 (s,1H,5-OH),8.08 (d,2H,J = 8.7 Hz,H-2 ,6 ),8.00 (s,1H,-NH-),7.11 (d,2H,J = 8.7 Hz,H-3 ,5 ),7.03 (s,1H,H-8),6.96 (s,1H,H-3),5.54 (d,1H,J = 5.4 Hz,H-1 ),5.25 (d,1H,J = 5.1 Hz,sugar hydroxyl),5.22 (d,1H,J = 5.0 Hz,sugar hydroxyl),5.15 (d,1H,J = 7.3 Hz,sugar hydroxyl),3.91 (d,1H,J = 9.7 Hz,H-5 ),3.86 (s,3H,-OCH3),3.77 (s,3H,-OCH3),3.52-3.37 (m,3H,H-2,3,4),3.06 (m,2H,-CH2),1.36-1.05 (m,8H,-CH2-),0.66 (t,3H,J = 6.7 Hz,-CH3);HRMS (ESI) m/z calcd for C29H35NO11[M+Na]+596.2210,found 596.2195。

目标化合物4d，黄色粉末，产率13%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm): 12.90 (s,1H,5-OH),8.11 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-2 ,6 ),7.98 (d,1H,J = 8.5 Hz,-NH-),7.11 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-3 ,5 ),7.08 (s,1H,H-8),6.97 (s,1H,H-3),5.53 (s,1H,H-1 ),5.25 (s,2H,sugar hydroxyl),5.08 (d,1H,J = 7.4 Hz,sugar hydroxyl),3.88 (s,1H,H-5 ),3.86 (s,3H,-OCH3),3.77 (s,3H,-OCH3),3.55-3.41 (m,3H,H-2 ,3 ,4 ),1.73-1.22 (m,11H,-CH2-,-CH3); HRMS (ESI) m/z calcd for C29H33NO11[M+Na]+594.2054,found 594.2123。

3.3 体外抗白血病细胞增殖实验

采用台盼蓝法测试目标化合物4a-d的抗肿瘤活性。选取人白血病细胞株HL-60和THP-1在37 C、5%CO2饱和湿度的培养箱中常规培养。培养液为含10%热灭活胎牛血清，青霉素100U/mL和链霉素100U/mL的RPMI1640细胞培养基。48h更换培养液，细胞贴壁后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。实验用细胞均处于对数生长期，台盼蓝拒染法表明细胞活力大于95%。

取对数生长期的受试细胞，以5×104cells/mL的密度接种于24孔板内，每孔内2mL。接种完毕后即加入相应浓度的待测药物。药物处理72h后，从每孔的细胞悬液中吸取50μL细胞悬液，加入50μL的0.4%台盼蓝溶液中混匀，在3min内，于光学显微镜下观察，分别计数每孔的细胞总数。每孔中的总细胞数占对照孔总细胞数的百分比即为该浓度药物的生长抑制率。