中药复方脊髓康促进脊髓损伤大鼠神经功能恢复的实验研究

邵阳 杨俊锋 马勇 徐辰 董赟 吴毛 王善付 殷杰 张素 王建伟

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)常见于严重脊柱外伤后，近些年数据显示，其发生概率逐年上升。脊髓损伤的发生涉及到机体各个系统，且并发症复杂、严重，治疗疗程长、所需费用高，效果也不甚满意，目前也没有有效方法可恢复脊髓损伤后的运动功能。因此，极高的致残率、不理想的复健效果给自身及国家带来了沉重负担。传统医学在治疗脊髓损伤方面，有较好的疗效，中药复方脊髓康是其中的代表制剂。研究发现，中药复方脊髓康在能够清除氧自由基、改善损伤局部的炎症反应、调节其免疫应答、减少细胞凋亡，有效改善神经生长环境，促进脊髓神经元的再生[1-3]。

研究发现，通过调节星形胶质细胞(astrocyte，AS)，是目前促进脊髓损伤复健的热点。当脊髓损伤发生时，AS相关的神经胶质原纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidicprotein，GFAP)高度表达，从而对神经再生产生物理屏障；活化的星形胶质细胞还可以分泌抑制性的细胞外基质分子如硫酸软骨素蛋白聚糖(Chondroitin sulfate proteoglycans，CSPG)等一大类蛋白多糖，抑制损伤后神经再生，从而对神经再生产生一种化学障碍，因此如何抑制星形胶质细胞，成为促进脊髓神经功能修复的关键。我们拟建立脊髓损伤大鼠模型，设立不同组别，研究中药复方脊髓康对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的影响，观察GFAP在不同治疗组中的表达程度。

1 材料与方法

1.1 大鼠及药物制备

清洁级雌性SD大鼠，120只，体重220～300 g。无锡市血液病防治研究所提供，大鼠生产许可证：SCXK(苏)2017-0007，适应性饲养7天。

中药复方脊髓康为南京中医药大学附属无锡附院的传统经验方(国家发明专利号：ZL200910026193.7)，实验用药由无锡市中医医院药剂科煎制，分为高、中、低三种浓度汤剂(2.5 g/mL、1.25 g/mL、0.625 g/mL)。冷藏备用。处方：生黄芪30 g、丹参20 g、川芎10 g、赤芍12 g、当归尾12 g、水蛭10 g、蜈蚣1条、制大黄10 g、泽泻10 g、茯苓10 g、枳实10 g、厚朴10 g、肉苁蓉10 g、淫羊藿10 g、地鳖虫10 g、车前子包15 g、益智仁10 g。

1.2 实验动物分组

共120只SD大鼠，随机分配，共六组，每组20只(选取标本时、随机挑选10只)。包括假手术组、模型组、脊髓康不同剂量组(高浓度、中浓度、低浓度)和强的松组。

1.3 模型制备

本方案采用改良Allen法打击大鼠T9-T11节段脊髓。成功造模，可见大鼠脊髓局部组织充血水肿，下肢肌肉痉挛、抽动，直至瘫痪。所有实验SD大鼠，积极预防感染，术后1～3天，予青霉素腹腔注射。加强护理，每日两次按摩膀胱，促进排尿。加强观察，预防术后并发症、降低死亡率。

1.4 标本采集

各组大鼠分别于3天、7天、14天三个时间点组，进行标本采集。以脊髓损伤大鼠造模损伤区为中心，逐层切开、分离肌肉组织，取出病损区域脊髓组织，10 mm左右，免疫组化实验取材后，放置于福尔马林溶液4℃冰箱保存。RT-PCR实验取材后，即刻送回实验室，-70℃冰箱保存。

1.5 观测指标

1.5.1 斜板实验、肌力检测评价 斜板实验：将SD大鼠置于倾斜木板顶端，观察其下落角度。以其能够静止于板上的最大角度为指标；随机抽取3只SD大鼠，在规定时间点，完成斜板实验测试。肌力：按改良的Tarlov标准评价脊髓损伤后肌力情况；分为五个等级：1分，大鼠后肢未见肌肉收缩；2分，大鼠后肢可见肌肉收缩，无关节活动；3分，后肢肌肉收缩、无法站立；4分，能站立，但行走不能；5分，大鼠后肢肌力正常。各组大鼠术前均为5分。随机抽取3只SD大鼠，在规定时间点，完成肌力测试。

1.5.2 免疫组化法观察GFAP的表达 按照实验步骤，取得各时间点标本，行组织梯度脱水、浸蜡、包埋等处理。行标本切片，随机选取3份样本用于检测。对切片洗涤、加入抗体、增强、复染等相关操作后，运用高倍显微镜观察染色的阳性表达情况。

1.5.3 RT-PCR法测定脊髓组织中GFAP mRNA表达 由生工生物工程(上海)股份有限公司进行引物设计并合成，经BLAST引物验证并预实验检测，熔解曲线均为单一峰形，未见其他峰值。具体序列见表1。

表1 基因序列表

由相关公司进行引物设计并合成，根据荧光定量PCR试剂盒说明书，按照qRT-PCR反应体系加样、操作，按两步法进行PCR反应程序。以管家基因GAPDH作为内参基因，分析GFAP在脊髓组织中的相对表达量。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 中药方对SCI大鼠斜板实验数据的影响

实验结果表明，脊髓损伤大鼠经中药复方脊髓康治疗后，术后第7天起脊髓康(中、高剂量组及强的松组)斜板实验数据较模型组明显增加(P<0.05)。第14天各给药组大鼠斜板实验数据较模型组明显增加(P<0.05)，中药各剂量组治疗效果与强的松组相似。见表2。

表2 各组大鼠脊髓斜板实验数据

2.2 中药复方脊髓康对脊髓损伤大鼠双后肢神经功能评分的影响

实验结果表明，脊髓损伤大鼠经中药复方脊髓康治疗后，术后第7天及第14天双后肢神经功能评分较模型组明显增加(P<0.05)，治疗效果与强的松组相似。其中中药复方脊髓康中等剂量组与强的松组在术后第3天时的评分较模型组增加(P<0.05)，低剂量及高剂量组未见明显差别。见表3。

表3 各组大鼠双后肢神经功能评分分)

2.3 免疫组化法观察GFAP蛋白的表达

假手术组镜下观察，发现AS散在分布，未见明显肥大、增生，形态正常。模型组镜下观察，可见神经纤维损伤，AS反应性活化明显，视野下密集分布，形态肥大。与模型组相比，强的松组视野下观察到的AS活化明显受到抑制，数量较少，但形态存在变化，肥大、增生。观察中药组可见活化的AS较少，与强的松组相比，星形细胞有部分肥大。见图1。

注：本组实验结果仅表明脊髓康能够发挥作用。具体组间差异并不明确，故中药组仅选一组作为示例。

2.4 RT-PCR法测定脊髓组织中GFAP mRNA表达

术后各个时间点，模型组GFAP mRNA表达量最高，且与各给药组的差异均有显著统计学意义(P<0.05)，且随着时间延长，在术后14天，模型组GFAP mRNA表达量达到顶峰，明显高于其他组别(P<0.01)。与强的松组相比，脊髓康高、低剂量组GFAP mRNA相对表达量偏高，差异有显著统计学意义(P<0.05)，脊髓康中剂量组在术后3天，GFAP mRNA与强的松组相比未见明显差异(P=0.064)。强的松组、脊髓康高、中、低剂量组在3天、7天、14天各时间点GFAP mRNA均呈动态表达，脊髓损伤3天时至最高峰，之后逐渐下降。见表4。

3 讨论

脊髓损伤的发生涉及到机体各个系统，且并发症复杂、严重，治疗疗程长、所需费用高，效果也不甚满意，目前也没有有效方法可恢复脊髓损伤后的运动功能。AS在体内一般存在形式有静止与活化两种。当SCI发生时，AS将由静止态转变为活化态。活化的AS会促使下游部分脱氢酶同工酶活性将显著增强，GFAP的表达水平也明显升高，AS形态将显著增大。当受到损伤、缺血等刺激时，AS将不断有丝分裂，体积变大，数量增多，形成网状结构。

表4 各组大鼠脊髓组织中GFAP mRNA表达鼠数3)

AS在脊髓损伤后的病理变化与以下情况有关：(1)接触抑制作用减弱：细胞间相互接触可以促进细胞周期素依赖性酶抑制剂P21蛋白的表达，同时可对pRb蛋白的磷酸化产生抑制作用，促使AS再次进入细胞周期。(2)高分子量葡萄糖胺聚糖透明质酸(HA)可以使AS保持在静止态，对AS的增殖起到抑制作用；当SCI时，HA的降低会促使AS的继发性增长。(3)脊髓损伤位置的AS还可经旁分泌、自分泌细胞因子来促使自身增殖。AS在白介素21B、睫状神经营养因子的刺激下将会由静止态转变为活化态；然后在成纤维细胞生长因子、转化生长因子-α等的作用下进入到细胞周期；再通过肿瘤坏死因子-γ、肿瘤坏死因子-α等作用形成胶质瘢痕。(4)黏蛋白C不仅能增值AS，也能一直AS，但未活化AS在长期作用下，会自行活化。

目前，AS已成为脊髓损伤治疗、修复神经元的潜在重要靶点之一。脊髓损伤后病损区域神经元持续生长、神经功能有效恢复的关键点，总结起来有以下几方面：(1)能够提供神经元生长的底物；(2)具有促进病损区域神经元生长的相关因子；(3)抑制胶质瘢痕增生形成所造成的屏障阻隔[4-6]。主流观点认为[7-11]，脊髓损伤后病损区域星形胶质细胞形成的“物理性屏障”及“化学系屏障”，是阻碍神经元再生及神经功能恢复的关键元凶。基于此理论，大量国内学者对中医药展开研究，以此明确其对于星形胶质细胞的作用及意义。因此，如何调控AS，同时减轻继发性脊髓损伤，是脊髓损伤后神经功能恢复的突破口之一[12-14]。

大量针对GFAP的研究已经明确了其作为AS活化的代表性产物，能够反映胶质细胞活化程度。而CSPG因其能够改善局部微环境，改善继发性脊髓损伤，而同样受到关注。研究发现，脊髓损伤后，脊髓损伤区域内可见CSPG表达上升[15-16]，治疗后感觉与运动功能恢复效果与之密切相关。鞠躬等[17]研究发现，在脊髓损伤后，CSPG是阻碍神经修复的关键因素，CSPG会结合周围不同细胞外基质，抑制神经再生。有学者采用干细胞移植、鞘内注射硫酸软骨素酶ABC等多种手段[18-19]，降低CSPG的表达，可明显改善脊髓损伤预后，促进运动功能恢复。目前研究报道大多认为，CSPG导致的继发性神经功能受损由糖胺聚糖链介导[20]。因此，去除糖胺聚糖链或可促进功能康复。

我们对造模大鼠进行研究，设立实验组及对照组，研究中药复方脊髓康对星形胶质细胞的作用效果及其内在机制。发现星形胶质细胞活化的标志行产物，GFAP在脊髓损伤区域呈强阳性表达，这一病理变化符合既往研究结果。

此次研究证实，中药复方脊髓康能够促进脊髓损伤大鼠运动及感觉功能的恢复，随着中药浓度的增加，其疗效有增加趋势。针对脊髓损伤大鼠脊髓损伤区域取材，行免疫组化及RT-PCR，可以明确大鼠脊髓损伤后损伤区域GFAP表达明显增高。在进行药物干预后，脊髓康各组及强的松组在GFAP表达上明显低于模型组，差异有显著统计学意义(P<0.05)；脊髓康组内各时间点比较，可以发现脊髓康中等剂量组在疗效上优于低剂量组及高剂量组，因此掌握合适的浓度也是提高疗效的关键点。

综上所述，中药复方脊髓康能够促进脊髓损伤大鼠斜板实验和双后肢神经功能评分改善；通过免疫组化及RT-PCR法观察，脊髓康组和激素组都能抑制GFAP表达，控制胶质瘢痕形成，减轻脊髓损伤后继发性损伤。