红鳍东方鲀与杂交鲀的性腺转录组比较分析

荆笛 张钰渤 刘圣聪

摘要 为分析红鳍东方鲀与杂交鲀（菊黄东方鲀♀×红鳍东方鲀♂）性腺发育的分子机制，该研究应用Illumina高通量测序技术对二者的卵巢和精巢组织进行转录组测序与生物信息学分析。结果表明：通过分析与筛选共得到差异表达基因（DEGs）4 157个（卵巢组织）和8 260个（精巢组织）。其中卵巢组织样本（O_2vsO_1）中表达上调的差异基因有1 912个，表达下调的有2 245个;精巢组织样本（T_2vsT_1）中表达上调的差异基因有4 234个，表达下调的有4 026个。通过GO功能注释与KEGG富集分析，在卵巢组织样本中（O_2vsO_1），差异表达基因主要归纳为93个功能类别与153条代谢通路;在精巢组织中（T_2vsT_1），差异表达基因可以主要归纳为73个功能类别与154条代谢通路，其中神经活性配体-受体相互作用过程、丝裂原活化蛋白激酶通路和钙信号通路的富集程度最高。该研究结果丰富了红鳍东方鲀与杂交鲀的转录组信息，为后续相关研究提供了大量有价值的转录组数据。

关键词 红鳍东方鲀;菊黄东方鲀;性腺;转录组;高通量测序

中图分类号 S917  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）18-0112-05

Abstract In this study， in order to analyze the molecule mechanism of gonad development between Takifugu rubripesand hybrid puffer（Takifugu flavidus♀× Takifugu rubripes♂）， the transcriptome and bioinformatics analysis were conducted for ovarian tissue and testis tissue by Illumina highthroughput sequencing technology. The results showed that a total of 4 157 （ovarian tissue） and 8 260 （testis tissue） differential expression genes （DEGs） were obtained. Among them， 1 912 genes were upregulated in ovarian tissue samples （O-2vsO-1）， while 2 245 genes were down regulated. 4 234 genes were up regulated in testis tissue samples （T-2vsT-1）， while 4 026 genes were down regulated. According to the analysis of GO function annotation and KEGG enrichment， the differentially expressed genes were mainly summarized in 93 functional categories and 153 metabolic pathways in ovarian tissue samples  （O-2vsO-1）.The differentially expressed genes can be divided into 73 functional categories and 154 metabolic pathways in testis tissue samples（T-2vsT-1）. Among them， the enriched levels were the highest of the process of neuroactive ligand receptor interaction， mitogen activated protein kinase pathway and calcium signaling pathway. This study results enrich the transcriptome information of Takifugu  rubripes and hybrid puffer fish，which provide much valuable information data for further research.

Key words Takifugu rubripes;Takifugu flavidus;Gonad;Transcriptome;High throughput sequencing

紅鳍东方鲀（Takifugu rubripes）是东方鲀属中个体最大的一种，也是被广泛养殖的一种优良鱼种。红鳍东方鲀肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富、蛋白含量高[1]，素有“百鱼之首”的美称，河鲀的内脏、卵巢、眼球、皮肤、血液均有毒，以卵巢、血液和肝脏毒性最大，处理不当或误食常可引起中毒，甚至死亡。菊黄东方鲀（Takifugu flavidus）同为东方鲀属，主要分布于东海、黄海、渤海等海域，属于温带近海底层鱼类，是东方鲀属中商品鱼价格最高的海水养殖种类。菊黄东方鲀与红鳍东方鲀不同，菊黄东方鲀生性比较温和，残咬的现象较轻，但是菊黄东方鲀体形较粗短并且生长较慢[2]，为中大型东方鲀，体长可达300 mm[3]。

杂种优势是指2个遗传基础不同的亲本杂交，杂种一代在生长势、生活力、抗逆性、产量和品质等方面比双亲优越的现象。因为杂种优势的存在，杂交后代一般会具有比亲本更优秀的性状。尽管鱼类的杂交相较于其他脊椎动物而言较为容易，但是在众多鱼类杂交的结果中，很少有后代能正常发育并达到苗种阶段，属间杂交中具有杂种优势并可以用于生产的有鳊鲂杂种、鲢鳙杂种、鲮湘华鲮杂种和鲫鲤杂种这4种杂交组合[4-6]。已有相关研究显示红鳍东方鲀和菊黄东方鲀的杂交后代，生长速度明显快于菊黄东方鲀而接近红鳍东方鲀，人工养殖一年半以上，杂交鲀体重即可超过菊黄东方鲀，同时杂交鲀保持了与菊黄东方鲀相似的口感，而且杂交鲀对低水温、重金属离子、盐度的波动均有良好的抗逆性[7-9]，红鳍东方鲀与菊黄东方鲀具有显著的经济杂交价值，将两者的品质优势和生长优势进行整合，是改良菊黄东方鲀经济性状的良好途径。

该研究利用Illumina高通量测序技术对红鳍东方鲀及杂交鲀进行性腺组织的转录组测序与分析，筛选与性腺相关的差异表达基因，为今后提高繁育技术和对菊黄东方鲀进行遗传改良提供基础数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 试验用鱼于2019年8月16日取自大连天正实业有限公司，唐山市咀东养殖场的红鳍东方鲀和杂交鲀（菊黄东方鲀♀×红鳍东方鲀♂），同一批孵化及同条件饲养情况下的18月龄成鱼各10条，其中雌鱼5条、雄鱼5条。采样所需的剪、咬骨钳、镊子、刀等器械均事先经过高压灭菌锅进行121 ℃，持续2 h灭菌，采样前使用乙醇（75%） 擦拭且经火焰消毒。将试验鱼在现场进行解剖，分别取全脑及肾脏组织储存于10倍体积的RNA later中。经过液氮处理后存放于-80 ℃冰箱中。

1.2 总RNA的提取与cDNA 文库构建和测序

将取样组织置于液氮中研磨，利用RNA提取试剂盒提取红鳍东方鲀和杂交鲀（菊黄东方鲀♀×红鳍东方鲀♂）的总RNA。为了保证试验数据的高质量，上述提取的总RNA需要进行琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计和Aglient 2100方法检测。通过完整性及纯度检测后，使用Oligo （dT）磁珠纯化和进行mRNA的富集，随后进行mRNA的分离及片段化，合成一链和二链cDNA。之后再进行3末端加A，连接测序接头末端修复，而后用AMPure XP beads筛选250～300 bp的cDNA，最后富集cDNA文库。将上述cDNA文库进行Illumina 测序，首先过滤原始数据中低质量、末端质量低、含测序引物的reads后得到了clean reads，然后再进行de novo拼接，最后通过CAP3软件拼接来获得最终Unigene序列集合[10]。 使用DEGseq 软件找寻筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）时以P<0.05作为标准（Anders S and Huber W）。

1.3 差异表达基因GO与KEGG富集分析

通过FPKM方法运用软件分析转录本与基因水平上的差异表达，在GO数据库和KEGG数据库中对比筛选，在数据库中注释结果来进一步分析。

2 结果与分析

2.1 测序质控分析 该研究分别取18月龄红鳍东方鲀与杂交鲀的性腺组织进行了转录组测序，在对数据进行初步分析后得知每个样本过滤后的序列数据不少于4 500万条，所测得的碱基长度不低于6.79 G，Q20均大于97%，Q30均大于94%，其中卵巢的GC含量為52.15%～52.67%，精巢的GC含量为50.60%～50.81%，卵巢的GC含量略高于精巢（表1）。表明测序所获得的数据真实可靠，具有优质的建库质量，数据可以用于后续分析（T_1为红鳍东方鲀精巢，O_1为红鳍东方鲀卵巢，T_2为杂交鲀精巢，O_2为杂交鲀卵巢）。

2.2 转录组与参考基因组的比对分析

测序片段（fragments）是mRNA随机打断的，为了确定这些片段由哪些基因转录而来，需要将质控后的clean reads比对到参考基因组上。HISAT2比对软件是由约翰霍普金斯大学的一个实验室开发，采用全局和局部搜索的方法，利用大量FM索引，覆盖整个基因组，能够将RNA-seq测得的reads与基因组进行快速精确的比对。结果表明，4个样品的clean reads与参考基因组的mapping率为91.32%～95.66%，单一位置的mapping率为79.20%～89.27%，多位置mapping率都小于12.12%，正链和负链的mapping率为39.62%～44.66%（表2），各mapping率比对效率较高，体现参考基因组组装较好，样本与参考基因组的亲缘关系较近，说明样本的外源污染较少，样本整体测序数据质量较好。

2.3 差异基因分析

根据FPKM法对样品间的差异进行分析，结果显示共得到差异表达基因（DEGs）共4 157个（卵巢组织）和8 260个（精巢组织）。其中杂交鲀的卵巢组织样本相对于红鳍东方鲀的卵巢组织样本表达上调的差异基因有1 912个，表达下调的有2 245个。根据各差异表达基因的水平不同（log2FC 高度不同），差异水平变化主要存在于0～2 （上调基因占48.08%，下调基因占51.92%），其次为2～7 （上调基因占53.26%，下调基因占46.74%），最后是>7～15 （上调基因占77.88%，下调基因占22.12%）;而杂交鲀的精巢组织样本相对于红鳍东方鲀的精巢组织样本表达上调的有4 234个，表达下调的有4 026个，同样主要集中在0～2 （上调基因占36.50%，下调基因占63.50%），其次为>2～7 （上调基因占55.83%，下调基因占44.17%），最后是>7～15 （上调基因占52.40%，下调基因占47.60%） （表 3） 。

火山图可直观展示每个比较组合的差异基因分布情况（图1）。图中横坐标表示基因在处理和对照两组中的表达倍数变化（log2FoldChange），纵坐标表示基因在处理和对照两组中表达差异的显著性水平，上调基因用红色点表示，下调基因用绿色点表示。

2.4 差异基因GO功能富集分析

GO（Gene Ontology）是描述基因功能的综合性数据库，可分为生物过程（biological process）、细胞组成（cellular component）和分子功能（molecular function）3个部分。从GO富集分析结果中，选取最显著的30个Term绘制散点图进行展示（图2）。图中横坐标为注释到GO Term上的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标为GO Term，点的大小代表注释到GO Term上的基因数，颜色从红到紫代表富集的显著性大小。

在卵巢组织样本中，差异表达基因主要归纳于58个生物过程、1个细胞组成和34个分子功能（图2A）。差异表达基因在分子功能中以跨膜转运蛋白活性（transmembrane transporter activity） （117个）居多;在生物过程上集中在生物附着（biological adhesion）（36 个）及细胞附着（cell adhesion）（36个）;在细胞组成上以细胞外区域（extracellular region）（70个）。这些富集基因的差异表达均已达到显著水平，且基因在表达中大多为上调。

在精巢组织中，差异表达基因主要归纳为8个生物过程，43个细胞组成，22个分子功能（图2B）。差异表达基因在分子功能中以三磷酸核苷酶活性（nucleosidetriphosphatase activity）（141个）， DNA结合转录因子活性（DNA binding transcription factor activity）（158个）， DNA序列特异性结合（sequencespecific DNA binding）（114个）为主;差异表达基因在生物学过程上以DNA代谢过程（DNA metabolic process）（75个）为主;差异表达基因在细胞组成上以细胞骨架（cytoskeletal）（106个），细胞骨架部分（cytoskeletal part）（89个），细胞外区域（extracellular region）（154个）为主。这些富集基因的差异表达均已达到显著水平，其中DNA代谢过程（DNA metabolic process）、三磷酸核苷酶活性（nucleosidetriphosphatase activity）在表达中上调，DNA结合转录因子活性（DNA binding transcription factor activity），DNA序列特异性结合（sequencespecific DNA binding）细胞骨架（cytoskeletal），细胞骨架部分（cytoskeletal part），细胞外区域（extracellular region）在表达中下调。结果表明红鳍东方鲀和菊黄东方鲀的杂交后代在性腺发育上主要是通过以上富集途径的差异表达基因来调控的。

2.5 差异基因KEGG分析

KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）是整合了基因组、化学和系统功能信息的综合性数据库。以KEGG数据库作为参考将红鳍东方鲀和杂交鲀的精巢卵巢进行两两比较，KEGG通路富集以padj小于0.05作为显著性富集的阈值，从KEGG富集结果中，选取最显著的20个KEGG通路绘制散点图进行展示（图3）。图中横坐标为注释到KEGG通路上的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标为KEGG通路，点的大小代表注释到KEGG通路上的基因数，颜色从红到紫，代表富集的显著性大小。

结果显示，在O_2vsO_1中有2 286个基因定位到153条代谢通路中，其中以丝裂原活化蛋白激酶通路（MAPK signaling pathway）中表达的基因最多，为73个，其次是神经活性配体-受体相互作用途径（neuroactive ligandreceptor interaction），为65个（图3A）。在T_2vsT_1中将3 952个基因定位到154条通路中，其中神经活性配体-受体相互作用途径（neuroactive ligandreceptor interaction）中包含的转录基因最多为185个，其次是钙信号通路（calcium signaling pathway）为108个（图3B）。

3 讨论

该研究应用Illumina高通量测序技术对红鳍东方鲀及杂交鲀（菊黄东方鲀♀×红鳍东方鲀♂）卵巢和精巢的转录组测序数据筛选到2 286个和3 952个差异表达基因进行GO富集分析和KEGG功能富集分析，结果显示杂交鲀与红鳍东方鲀的差异表达基因主要富集在神经活性配体-受体相互作用途径（neuroactive ligandreceptor interaction），丝裂原活化蛋白激酶通路（MAPK signaling pathway），钙信号通路（calcium signaling pathway）中差异基因富集程度最高。

在杂交鲀与红鳍东方鲀卵巢（O_2vsO_1）的比较中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK signaling pathway） 通路差异基因富集程度最高，其是细胞增殖、分化、凋亡等信号转导通路的一条重要共同交汇通路。已有研究发现p38MAPK 参与了对文蛤的致病性弧菌的免疫反应[11]，微囊藻毒素通过调节斑马鱼MAPK途徑破坏了减数分裂的正常进行[12]。由此可以看出MAPK在水产动物正常的生长发育中起到重要作用。MAPK的显著富集原因可能是许多种生长因子受体、营养相关因子受体等都需要MAPK的活化来完成信号转导过程。这说明在杂交鲀卵巢的发育过程中MAKP通路对杂交鲀卵巢的发育有重要作用。

在杂交鲀与红鳍东方鲀卵巢（O_2vsO_1）与精巢（T_2vsT_1）的比较中，神经活性配体-受体相互作用途径的差异基因富集程度都很高，其受到生长激素（growth hormone，GH）和催乳素（prolactin，prl） 的调控[13]。催乳素可以维持体内外电解质和水的平衡，调节内分泌与新陈代谢，脑功能和行为条件，免疫调节和保护，繁殖以及促进生长和发育[14];而已有研究证实生长激素可以促进消化系统的氨基酸吸收及增加组织细胞的RNA合成进而促使鱼体蛋白质合成，提高食物转化率，还有调节鱼类生殖功能、促进体细胞分裂、增强鱼体免疫力和刺激骨骼肌肉组织发育等效果[15-16]，说明其在鱼的卵巢和精巢生长发育过程中都发挥了重要作用。初步推测神经活性配体-受体相互作用过程、丝裂原活化蛋白激酶通路和钙信号通路可能是杂交鲀杂交优势的主要由来，但还需要进一步研究证明。

该研究通过对红鳍东方鲀及杂交鲀的转录组比较分析，揭示了神经活性配体-受体相互作用途径可能参与调控出了杂交鲀的杂交优势，丝裂原活化蛋白激酶通路与钙信号通路分别对杂交鲀的卵巢与精巢的发育有一定作用，为后期继续进行杂交鲀和红鳍东方鲀生长发育差异过程的相关分子调控机制的研究提供了初步理论依据与参考，有利于进一步提高杂交河鲀的经济价值。

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