ESAT-6联合MMP-14检测在HIV并肺结核患者病情评估中价值

陆霓虹 夏加伟 刘洪璐

[摘要] 目的 探討早期分泌靶向抗原（ESAT-6）及基质金属蛋白酶14（MMP-14）在人类免疫缺陷病毒（HIV）并肺结核患者病情严重程度评估中的价值。 方法 回顾性分析2018年7月—2019年7月于昆明市第三人民医院确诊的HIV感染并肺结核患者42例（A组）、单纯肺结核患者50例（B组）及门诊健康体检者21名（C组）。抽取空腹静脉血完成ESAT-6、MMP-14及免疫功能的检测。 结果 三组人群ESAT-6表达比较，差异有统计学意义（P < 0.05），其中C组未见表达。三组人群MMP-14、CD4+T、CD8+T及CD3+T细胞水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。其中A、B组患者MMP-14高于C组，且A组高于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）;A、B组患者CD4+T、CD8+T、CD3+T细胞水平低于C组，且A组低于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）。ESAT-6与CD4+T、CD8+T表达呈负相关（r = -0.34、-0.48，P < 0.05）。MMP-14表达与CD4+T、CD8+T、CD3+T表达呈负相关（r = -0.32、-0.33、 -0.54，P < 0.05）。MMP-14与病情严重程度呈正相关（r = 0.78，P = 0.00）。 结论 ESAT-6与MMP-14在HIV并肺结核重症患者中表达增高，MMP-14在病重患者中升高明显，两者与疾病进展密切相关，可以进一步评估该类患者预后。

[关键词] 人类免疫缺陷病毒合并肺结核;肺结核;靶向抗原;基质金属蛋白酶14

[中图分类号] R446.11          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）08（b）-0115-04

[Abstract] Objective To explore the value of early secretion of targeted antigen （ESAT-6） and matrix metalloproteinase 14 （MMP-14） in the evaluation of the severity of human immunodeficiency virus （HIV） patients with tuberculosis. Methods A retrospective analysis was made on 42 cases of HIV complicated with tuberculosis infection（group A）， 50 cases of tuberculosis infection （group B） and 21 people of health examination （group C） in outpatient clinic from July 2018 to July 2019 in Kunming Third People′s Hospital. Fasting venous blood was taken to detect ESAT-6， MMP-14 and immune function. Results The expression of ESAT-6 in the three groups were compared， and the difference were statistically significant （P < 0.05）， while there was no expression in group C. Comparison of the levels of MMP-14， CD4+T， CD8+T and CD3+T cells in the three groups showed statistically significant differences （P < 0.05）. Among them， the MMP-14 of patients in group A and B were higher than those in group C， while group A was higher than that in group B， and the differences were statistically significant （P < 0.05）; the levels of CD4+T， CD8+T and CD3+T cells in group A and B were lower than those in group C， while group A was lower than that in group B， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. ESAT-6 was negatively correlated with the expression of CD4+ T and CD8+ T （r = -0.34， -0.48， P < 0.05）. The expression of MMP-14 was negatively correlated with the expression of CD4+ T， CD8+ T， and CD3+ T （r = -0.32， -0.33， -0.54， P < 0.05）. MMP-14 was positively correlated with the severity of the disease （r = 0.78， P = 0.00）. Conclusion The expression of ESAT-6 and MMP-14 are increased in severely ill patients with HIV and tuberculosis， and MMP-14 is significantly increased in severely ill patients. Both are closely related to disease progression， and the prognosis of these patients can be further evaluated.

[Key words] Human immunodeficiency virus with tuberculosis; Tuberculosis; Early secretary antigentic target 6kDa protein; Matrix metalloproteinase 14

人类免疫缺陷病毒（HIV）的播散导致人体免疫功能下降，机会性感染增加[1]。HIV感染常伴结核分枝杆菌（MTB）感染，患者病情易进展为获得性免疫缺乏综合征（AIDS），进一步增加患者死亡率[2]。2018年世界卫生组织报道HIV并肺结核患者逐年增加，严重威胁人类健康[3]。靶向抗原（ESAT-6）为致病性MTB特异性抗原，基质金属蛋白酶14（MMP-14）为炎症特异因子，二者表达增加是否与病情严重程度相关，目前仍未可知[4]。本研究拟分析HIV并肺结核患者、单纯性肺结核患者与健康者ESAT-6与MMP-14的表达情况，评估ESAT-6与MMP-14在疾病进展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年7月—2019年7月昆明市第三人民医院（以下简称“我院”）收治的HIV并肺结核患者为A组（42例），单纯肺结核患者为B组（50例），健康对照组为C组（21名）。A组女18例，男24例;年龄23～65岁，平均（41.90±13.21）岁;HIV感染者30例，AIDS患者12例;肺部有空洞病灶18例，伴有肺外结核20例。B组女24例，男26例;年龄18～70岁，平均（44.42±15.07）岁;轻症结核27例，重症结核23例;肺部有空洞病灶24例，伴有肺外結核16例。C组女10名，男11名;年龄22～61岁，平均（37.57±13.17）岁。三组人群性别、年龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。A、B组病情严重程度，肺部有无空洞病灶，有无肺外结核比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究已通过我院医学伦理委员会审核，所有入组患者均签署知情同意书。

1.2 诊断、纳入及排除标准

1.2.1 HIV抗体检测  所有HIV病例均经酶联免疫吸附试验（ELISA）初筛，阳性者送云南省疾病预防控制中心用蛋白印迹法（WB）确诊，AIDS诊断则按中华人民共和国国家标准《HIV/AIDS诊断标准和处理原则》[5]。

1.2.2 肺结核诊断标准  根据肺结核的诊断标准进行诊断[6]。

1.2.3 HIV并肺结核患者诊断  ①HIV检测阳性;②痰查抗酸杆菌阳性（排除非结核分枝杆菌）;③有肺结核的影像学表现。痰查阴性者除上述①、③还包括：④有结核病的相关临床症状;⑤抗结核治疗有效;⑥实验室检查支持肺结核诊断;⑦排除糖尿病等其他导致免疫功能低下的疾病。

1.2.4 纳入标准  ①符合上述诊断标准;②年龄18～70岁;③首次发病就诊，检查资料完整。

1.2.5 排除标准  合并其他肺部病变或其他系统严重疾病致免疫功能低下者。

1.3 方法

1.3.1 设备  美国BD公司FACS Calibur型流式细胞仪;德国Eppendorf移液器;中国海尔4℃或-20℃冰箱;美国Thermo scientific公司ST 8R高速冷冻离心机;美国Molecular公司SPECTCA MAX190酶标仪;中国上海森信DGG-9140B电热恒温鼓风干燥箱。

1.3.2 试剂  人ESAT-6 ELISA试剂盒购自英国Oxford公司，生产批号：0903H;人MMP-14定量分析酶免疫检测试剂盒（生产批号：07/2019）购自上海巧伊生物科技有限公司。

1.3.3 试验方法  采集各组人群清晨空腹静脉血6 mL，室温静置15～30 min后以3000 r/min速度离心15 min，离心半径为16.80 cm，离心后取上清。血清ESAT-6和MMP-14浓度的检测按试剂盒说明书进行，终止反应后置于450 nm波长的酶标仪上读取各孔的吸光度（OD）值，以标准品OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线，根据被检测标本的OD值及标准曲线算出相应的浓度。外周血T淋巴细胞亚群计数采用流式细胞分析仪进行检测。

1.4 统计学方法

运用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD多重比较。计数资料以例数表示，采用χ2检验。相关性分析采用线性相关Pearson及等级相关Spearman进行分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组人群实验室指标比较

三组人群ESAT-6表达比较，差异有统计学意义（P < 0.05），其中C组未见表达。三组人群MMP-14、CD4+T、CD8+T及CD3+T细胞水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。其中A、B组患者MMP-14高于C组，且A组高于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）;A、B组患者CD4+T、CD3+T、CD8+T细胞水平低于C组，且A组低于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 ESAT-6、MMP-14与免疫功能相关性分析

ESAT-6与CD4+T、CD8+T表达呈负相关（r = -0.34、-0.48，P < 0.05）。MMP-14表达与CD4+T、CD8+T、CD3+T表达呈负相关（r = -0.32、-0.33、-0.54，P < 0.05）。

2.3 ESAT-6、MMP-14与病情严重程度分析

ESAT-6与病情严重程度无相关性（P > 0.07）。MMP-14与病情严重程度呈正相关（r = 0.78，P = 0.00）。

3 讨论

HIV并肺结核的发病率逐年上升，尤其是进展到AIDS并肺结核的患者死亡率更高[7]。如何评估该类患者的严重程度及疾病进展变化，从而调整治疗方案，减少患者死亡率，是目前临床研究的重点。

ESAT-6是6 kD早期分泌靶向抗原，是从结核杆菌短期培养滤液（ST-CF）中纯化分离出的一种低分子量分泌性蛋白，具有较强的细胞免疫活性，仅在致病性MTB中表达[8-9]。HIV并肺结核患者免疫功能受损严重，病情进展较快。本研究显示，与C组比较，ESAT-6在A、B組患者中表达均上升，差异有统计学意义（P < 0.05）。研究显示[8]ESAT-6具有帮助MTB免疫逃逸的作用，能加强MTB的侵袭性，加重病情。通过研究结果分析监测ESAT-6的变化，可以进一步评估患者病情。

本研究显示，ESAT-6与免疫系统T淋巴细胞亚群受损密切相关，A、B组ESAT-6表达上升，CD3+T、CD4+T细胞降低，与C组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。提示ESAT-6的免疫活性促进MTB侵袭，巨噬细胞表达下降，进一步导致T淋巴细胞，尤其是CD4+T表达降低，符合文献报道[10-12]。

MMPs主要与动脉粥样硬化具有相关性，近年研究显示MMPs与炎症、肿瘤也具有一定相关性[13-16]。MMPs充当HIV-1病毒Tat蛋白对宿主的攻击与细胞外基质之间的接口，后者通过降解细胞外基质（ECM）导致内皮屏障的破坏。该过程启动了病毒在组织中的传播，可能导致HIV-1感染增加[17-18]。

MMP-14为MMPs家族中的一员，主要促进降解ECM加重炎症反应，促进病情进展[19-20]。既往研究中主要显示MMP-9在HIV患者神经系统疾病中表达升高，可以进一步评估预后[21]。然而，关于MMP-14的相关研究较少。本研究显示MMP-14在A组患者中表达升高，尤其在AIDS并肺结核患者中表达明显升高，提示MMP-14与免疫功能下降及疾病严重程度密切相关。本研究结果显示MMP-14可以作为一个临床监测指标进一步评估HIV并肺结核患者疾病进展及预后分析。

综上所述，ESAT-6联合MMP-14可以作为HIV并肺结核患者疾病严重程度及预后分析的主要监测指标，进一步应用于临床，具有良好的实用性及科研价值。

[参考文献]

[1]  Ding P，Li X，Jia Z，et al. Muhidrug-resistant tuberculosis（MDR-TB）disease burden in China：a systematic review and spatiotemporal analysis [J]. BMC Infect Dis，2017，17（1）：57.

[2]  Chanda-Kapata P，Kapata N，Klinkenberg E，et al. The prevalence of HIV among adults with pulmonary TB at a population level in Zambia [J]. BMC Infect Dis，2017，17（1）：236.

[3]  World Health Organization. Global tuberculosis report 2018 [M]. Geneva：World Health Organization，2018.

[4]  Wang X，Wu Y，Wang M，et al. The sensitivity of T-SPOT.TB assay in diagnosis of pediatric tuberculosis [J]. Fetal Pediatr Pathol，2014，33（2）：123-125.

[5]  国家技术监督局.HIV/AIDS诊断标准及处理原则[J].中国性病艾滋病防治，1998，4（2）：85-87.

[6]  高孟秋.《WS288-2017肺结核诊断》新标准中关于临床诊断患者判定的解析[J].中国防痨杂志，2018，40（3）：243-246.

[7]  Hall EW，Morris SB，Moore BK，et al. Treatment Outcomes of Children with HIV Infection and Drug-Resistant TB in Three Provinces in South Africa，2005-2008 [J]. Pediatr Infect Dis J，2017，36（12）：e322-e327.

[8]  Uplekar S，Heym B，Friocourt V，et al. Comparative genomics of Esx genes from clinical isolates of Mycobacterium tubeculosis provides evidence for gene conversion and epitope variation [J]. Infect Immun，2011，79（10）：4042-4049.

[9]  Scherrer S，Landolt P，Friedel U，et al. Distribution and expression of esat-6 and cfp-10 in non-tuberculous mycobacteria isolated from lymph nodes of slaughtered cattle in Switzerland [J]. J Vet Diagn Invest，2019，31（2）：217-221.

[10]  商勇，陆燕春，解承鑫，等.不同肺结核类型患者细胞免疫功能相关性研究[J].临床肺科杂志，2017，22（7）：1176-1179.

[11]  Zhang L，Cheng X，Bian S，et al. Utility of Th1-cell immune responses for distinguishing active tuberculosis from  non-active tuberculosis：A case-control study [J]. PLoS One，2017，12（5）：e0177850.

[12]  Moguche AO，Musvosvi M，Penn-Nicholson A，et al. Antigen Availability Shapes T Cell Differentiation and Function during Tuberculosis [J]. Cell Host Microbe，2017， 21（6）：695-706.

[13]  Newby AC. Matrix metalloproteinase inhibition therapy for vascular diseases [J]. Vascular Pharmacology，2012，56（5/6）：232-244.

[14]  Mehana EE，Khafaga AF，El-Blehi SS. The role of matrix metalloproteinases in osteoarthritis pathogenesis：An updated review [J]. Life Sci，2019，234（1）：1167-1186.

[15]  Peters F，Becker-Pauly C. Role of meprin metalloproteases in metastasis and tumor microenvironment [J]. Cancer Metastasis Rev，2019，38（3）：347-356.

[16]  Harman JL，Dobnikar L，Chappell J，et al. Epigenetic Regulation of Vascular Smooth Muscle Cells by Histone H3 Lysine 9 Dimethylation Attenuates Target Gene-Induction by Inflammatory Signaling [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2019，39（11）：2289-2302.

[17]  Yu T，Jiang QJ，Yan TU，et al. Experimental Research on the Prevention and Treatment of Shufeng Xuanfei，Prescriptions on the Rat Chronic Serous Glomerulonephritis [J].世界最新醫学信息文摘：电子版，2012，12（2）：62-64.

[18]  Tadokera R，Meintjes GA，Wilkinson KA，et al. Matrix metalloproteinases and tissue damage in HIV-tuberculosis immune reconstitution inflammatory syndrome [J]. Eur J Immunol，2014，44（1）：127-136.

[19]  Zaldivia MTK，Mcfadyen JD，Bock L，et al. Platelet-Derived Microvesicles in Cardiovascular Diseases [J]. Front Cardiovasc Med，2017，4：74.

[20]  Aguirre A，Blazquez-Prieto J，Amado-Rodriguez L，et al. Matrix metalloproteinase-14 triggers an anti-inflammatory proteolytic cascade in endotoxemia [J]. J Mol Med （Berl），2017，95（5）：487-497.

[21]  Huang W，Andras IE，Rha GB，et al. PPARalpha and PPARgamma protect against HIV-1-induced MMP-9 overexpression via caveolae-associated ERK and Akt signaling [J]. FASEB J，2011，25（11）：3979-3988.

（收稿日期：2019-10-29）