响应面优化红树莓-蓝莓复合果酒澄清工艺研究

吕长鑫，巴俊文，纪秀凤，王新明，王妍惠，张新宇，周文萱，王维民

（1.渤海大学 食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州121013；2.大连 中超食品有限公司，辽宁 大连116400）

0 引言

红树莓为蔷薇科悬钩子属木本植物，别名覆盆子、托盘和马林果等，在我国东北地区多有种植［1］.红树莓果实柔嫩多汁，酸甜可口，含有大量花色苷和黄酮等活性物质，具有提高肌体免疫力和预防心脑血管疾病等功效，食用价值较高，被世界粮农组织誉为第三代“黄金水果”［2-3］.蓝莓为杜鹃花科越橘属多年生灌木小浆果果树［4］.蓝莓果实中含有丰富的营养成分，具有保护视力和抗癌等功能，享有“水果皇后”之称誉，且被推荐为五大健康水果之一［5-6］.

红树莓和蓝莓均富含多种营养物质，但均不耐贮藏，将二者复合制成果酒，克服了单一果酒色香味欠佳和营养不足等缺陷，使其更加美味可口，更具营养保健价值.果酒在酿制过程中由于一些生物性或非生物性等因素，易产生絮状物质而生成沉淀，影响果酒品质［7］.果酒澄清度是衡量酒体品质的重要因素［8］，因此，本实验对红树莓-蓝莓复合果酒澄清工艺进行研究.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红树莓：锦州义县；蓝莓：锦州南山果园；明胶、壳聚糖、皂土、硅藻土：武汉祥达食品添加剂有限公司；柠檬酸：河南万邦实业有限公司；白砂糖：南宁糖业股份有限责任公司；果胶酶、纤维素酶：南宁庞博生物工程有限公司；亚硫酸氢钠：河北鹏宇生物科技有限公司；酵母：安琪酵母股份有限公司.

1.2 仪器与设备

BCD-212冰箱：博西华家用电器有限公司；UV-2700紫外分光光度计：日本岛津公司；MIR-254-PC低温恒温培养箱：松下健康医疗器械株式会社；Centrifuge5804R冷冻离心机：德国艾本德仪器有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 红树莓-蓝莓复合果酒制作工艺流程发酵→澄清→陈酿→灌装→密封→杀菌→冷却→成品.

1.3.2 操作要点

分别将解冻后的红树莓和蓝莓打浆后，按果胶酶与纤维素酶9：1的质量比各添加0.1%的果胶酶和纤维素酶复合酶，在45 ℃条件下酶解2 h后过滤取汁，添加100 mg/L亚硫酸氢钠，利用碳酸氢钠调节果汁pH至3.8，再添加200 g/L白沙糖.配置2%蔗糖水溶液，称取酵母，酵母与蔗糖水质量比为1：10，在40 ℃条件下活化25 min.将调整好的果汁加入活化后酵母菌液中，在28 ℃发酵7 d后倒罐，20 ℃后发酵10 d.

1.3.3 不同澄清方式对复合果酒透光率影响

1.3.3.1 自然澄清法

取六支具塞试管，每支试管中放20 mL果酒，分别室温放置5、10、15、20、25和30 d后离心12 min，转速为4000 r/min.取3 mL离心后上清液于比色皿中，在波长800 nm下测定透光率.

1.3.3.2 冷冻澄清法

取20 mL果酒于七个容器中，在-15 ℃条件下分别冻藏2、4、6、8、10、12和14 d后取出，4000 r/min离心12 min，取3 mL上清液于比色皿中，800 nm下测定透光率.

1.3.3.3 澄清剂澄清法

分别配置壳聚糖溶液、明胶溶液、皂土悬浮液和硅藻土悬浮液，备用［9］.取20 mL果酒于具塞试管中，依次加入0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL配置好的壳聚糖溶液、明胶溶液、皂土悬浮液和硅藻土悬浮液做澄清剂，50 ℃下处理1 h后室温静置72 h，在4000 r/min下离心12 min，取3 mL离心后上清液于比色皿中，在波长为800 nm下测透光率，遴选出两种澄清效果最好的澄清剂进行复合.

1.3.4 复合澄清剂澄清单因素试验

1.3.4.1 复合澄清剂配比的选择

取20 mL果酒至具塞试管中，复合澄清剂总添加量为1.4 mL，壳聚糖与皂土按体积比为2：5、3：4、4：3、5：2、6：1加入，在50 ℃下处理50 min后静置72 h，在4000 r/min条件下离心12 min，取3 mL上清液于比色皿中，在波长为800 nm下测定透光率.

1.3.4.2 澄清温度的选择

取酒样20 mL至试管中，壳聚糖与皂土体积比为4：3，分别在40、45、50、55、60 ℃下保温50 min后静置72 h，4000 r/min条件下离心12 min，取3 mL离心后上清液于比色皿中，在波长为800 nm下测定透光率.

1.3.4.3 澄清时间的选择

取酒样20 mL至试管中，壳聚糖与皂土体积比为4：3，水浴温度为50 ℃，水浴时间分别水浴30、40、50、60、70 min，澄清结束后室温静置72 h，在4000 r/min条件下离心12 min，测定其透光率.

1.3.5 响应面优化试验

在单因素试验基础上进行响应面优化试验，以透光率为响应值，进行试验设计，水平因素表见表1.

表1 响应面试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 自然澄清对复合果酒透光率的影响

图1为自然澄清对果酒透光率的影响.由图可知，在自然澄清0～20 d期间果酒透光率上升较为明显，超过20 d果酒透光率趋于平稳.因此自然澄清20 d效果最佳.

2.2 冷冻澄清对复合果酒透光率的影响

由图2可知，冷冻后果酒透光率较自然澄清有所提高.冷冻时间在0～6 d期间果酒透光率上升较为明显；超过6 d时，透光率略有下降后趋于平稳.因此冷冻时间6 d对复合果酒澄清效果最佳.

2.3 澄清剂澄清对复合果酒透光率的影响

图3为四种澄清剂对果酒透光率的影响，由图可以看出，在澄清剂添加量不断增加的过程中，四种澄清剂透光率均先增高后降低，这说明壳聚糖、皂土、硅藻土以及明胶浓度过高会破坏与果酒形成的稳定体系，导致红树莓-蓝莓复合果酒透光率下降.在四种澄清剂中皂土澄清效果最好，其次为壳聚糖，硅藻土澄清效果最差，因此研究壳聚糖与皂土复合澄清剂对果酒透光率的影响.

2.4 复合澄清剂澄清单因素试验结果分析

2.4.1 复合澄清剂配比对果酒澄清效果影响分析

由壳聚糖和皂土复配澄清剂对果酒进行澄清作用研究结果可知，透光率均可达86%以上，澄清效果显著.从图4可以看出，透光率随着复配澄清剂比例不断增加呈现先上升后下降的趋势.当壳聚糖与皂土体积比为4：3时红树莓-蓝莓复合果酒透光率达到89.5%，此时透光率最高；继续增大复配澄清剂比例，透光率呈下降趋势.红树莓-蓝莓复合果酒中含有带负电荷的分子，而在酸性条件下，壳聚糖在果酒中会形成带有正电荷的分子，此时果酒中带有正负电荷的微粒相互吸引，使红树莓-蓝莓复合果酒中果胶和单宁等颗粒物质絮凝并产生沉淀［10］，从而增大果酒透光率；壳聚糖与皂土所形成的电荷恰好相反，因此对二者进行复合与单一澄清剂相比优势明显［11］.过量壳聚糖所形成的胶体系统反而会造成红树莓-蓝莓复合果酒混浊，导致其透光率下降.

2.4.2 澄清温度对果酒澄清效果影响分析

由图5可知，果酒透光率随着澄清温度的不断增大呈现先升高后降低的趋势.澄清温度在低于50 ℃期间透光率呈上升趋势明显；当温度达到50 ℃时透光率达到88.9%，此时澄清效果最佳；而当温度在50～60 ℃期间，透光率呈急速下降趋势.表明适宜得温度使壳聚糖与皂土吸附正负电荷效果更加显著，二者共同作用吸附红树莓-蓝莓复合果酒中带电的颗粒物质，使红树莓-蓝莓复合果酒产生沉淀从而提高红树莓-蓝莓复合果酒澄清度［12］.若澄清温度过高会分解红树莓-蓝莓复合果酒中部分活性物质，从而导致果酒透光率下降［13］.

2.4.3 澄清时间对果酒澄清效果影响分析

从图6可以看出，果酒透光率随着澄清时间延长呈现先升高后降低的趋势.澄清时间在40～50 min期间，透光率具有明显上升趋势；当澄清时间为50 min时透光率可达89.3%；继续增加澄清时间，红树莓-蓝莓复合果酒澄清度逐渐下降，说明适当澄清时间会使红树莓-蓝莓复合果酒中正负电荷之间更好作用使红树莓-蓝莓复合果酒产生絮凝并沉淀.澄清时间过长会使其粘度过大，影响果酒品质和澄清度［14-15］.

2.5 响应面优化复合澄清剂澄清试验

2.5.1 模型建立及显著性分析

以透光率为响应值，在单因素试验基础上，以A（复合澄清剂比例）、B（澄清温度）和C（澄清时间）为考察因素进行响应面优化试验，试验结果见表2.

表2 响应面试验设计及结果

为检验各因素对复合果酒透光率的影响程度和回归方程的有效性，对以上试验结果进行方差分析，由表3可以看出，模型p＜0.0001，失拟相p=0.1631＞0.05，说明以以上3因素为考察因素的模型极显著，失拟相不显著，方程拟合度较好.由F值可以看出，水浴温度、水浴时间和复合澄清剂比例对红树莓-蓝莓复合果酒透光率的影响顺序依次为：水浴温度＜水浴时间＜复合澄清剂比例.模型中复合澄清剂配比和澄清时间（AC）对红树莓-蓝莓复合果酒透光率无显著影响，复合澄清剂配比和澄清温度（AB）对果酒透光率影响显著，而因素A、B、C、BC、A2、B2、C2均对果酒透光率具有极显著影响.对表2试验数据进行回归拟合，得到红树莓-蓝莓复合果酒透光率（Y）对复合澄清剂比例（A）、水浴温度（B）及水浴时间（C）的二次多项回归模型为：Y=91.60+0.52A-0.30B+0.45C-0.26AB+0.080AC-0.60BC-0.65A2-0.84B2-0.59C2. 变异系数CV=0.23%，CV值越小，表明试验有良好精确度和可信性.总决定系数R2=0.9776，校正系数R2Adj=0.9487，可以良好地反映出红树莓-蓝莓复合果酒透光率与以上3个因素之间关系.

表3 方差分析表

2.5.2 响应面各因素间交互作用分析

图7依次展示了AB、AC和BC三组交互作用与红树莓-蓝莓复合果酒透光率构成的等高线图及3D图.图7a为因素AB交互作用的等高线图，图7b为因素AB交互作用的3D图，由两图可以看出等高线图呈椭圆形，且3D图较陡峭，说明AB交互作用对红树莓-蓝莓复合果酒透光率影响显著［16-17］；图7c中AC交互作用的等高线图椭圆不明显，且结合表3可知AC交互作用不显著，因此不做解释；图7e为因素BC交互作用的等高线图，图7f为因素BC交互作用的3D图，由图可以看出BC交互作用等高线图呈椭圆形，3D较陡峭，说明因素BC间交互作用对红树莓-蓝莓复合果酒透光率产生极显著影响.

2.5.3 验证试验

由Design Expert软件分析可以预测出最佳优化条件为：复合澄清剂配比9：5，澄清温度47.48 ℃，澄清时间56.75 min，红树莓-蓝莓复合果酒透光率预测值为91.97%.实际测得的红树莓-蓝莓复合果酒透光率为92.36%，与预测值的相对误差为0.42%，所建模型准确可靠.

3 结论

本文通过对自然、澄清剂和冷冻三种澄清法比较，结果表明澄清剂澄清效果最好，且针对壳聚糖和皂土进行复合澄清剂进行研究，在单因素基础上且通过响应面优化得到最佳澄清工艺条件：澄清温度47 ℃、澄清时间57 min、复合澄清剂配比9：5，果酒透光率预测值为91.97%，按此条件进行3次平行实验，所得复合果酒平均透光率为92.36%，响应面模型与实际值拟合良好，在实际生产中具有一定应用价值.