红树莓叶片早衰对其营养成分含量和主要酶活性的影响

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（1.河北农业大学 林学院，河北 保定 071000；2.河北省核桃工程技术研究中心，河北 邢台 054000）

红树莓Rubus idaeus为蔷薇科悬钩子属Rubusspp.的多年生落叶小灌木，又名托盘、红马林，中草药名称“覆盆子”[1]。树莓在世界上被誉为“黄金水果”“水果之王”[2]，也是联合国粮农组织推荐的健康小浆果果树，被誉为“第3 代小浆果”[3]，有生态效益好、抗病虫性强、投资效益高、管理简便、产业延伸链条长、市场范围广[4]等优点。有研究结果表明，红树莓可以增强人体免疫力[5]、抗衰老[6-7]、抗肿瘤[8]、降血糖[9]、降血脂[10]，具有极大的经济价值。红树莓双季品种‘海尔特兹’表现优良，但在部分植株上出现叶片早衰的现象。刘海鹏等[11]通过研究不同时期早衰‘海尔特兹’红树莓不同部位的不同矿质元素含量与正常红树莓的差异，发现红树莓叶片早衰是由缺氮、磷、镁、铁引起的。国内外对红树莓的研究主要集中在红树莓加工生产[12-14]、贮藏保鲜方法[15-17]、栽培修剪措施[18-19]、病虫害防治[20]等方面。本课题组在前期研究中发现，红树莓年生长周期中果实成熟盛期，生殖生长的同时伴随营养生长，尤其是果实大量成熟期，这一时期不同初生茎进入生殖生长的发育状态不同，初生茎对营养元素的需求及叶片外在衰老表现亦有较大差异，叶片早衰严重影响果实发育，表现为果实小、单果小核果数量减少等，严重影响果实品质。因此，亟待进行红树莓果实成熟盛期初生茎不同发育阶段的营养变化的研究。本研究中对同一时期不同发育阶段‘海尔特兹’红树莓叶片主要矿质元素含量及主要酶活性变化进行研究，以期为红树莓合理施肥及延缓叶片早衰提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

2018年8月，在河北省邢台市内丘县红树莓园区进行试验。试验地属冀中平原地区，海拔30 ～50 m，温带大陆性季风气候明显，年平均气温13.2 ℃，年平均降水量499.6 mm，无霜期196 d。

1.2 试验材料

试验材料为5年生‘海尔特兹’红树莓，株行距为0.5 m×2.0 m，株高1.3 ～1.4 m。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的采集与处理

随机选取同一时期不同发育阶段、不同早衰程度的红树莓初生茎，采集叶片。营养生长期（VGS），无花序，叶片生长正常且无任何早衰现象；初花期（PFS），初生茎花序量25% ～30%，叶片25%～30%发生早衰；盛花期（FFS），花序量70%～80%，叶片40%～50%发生早衰；果实成熟初期（PRS），25%～30%果实成熟，叶片60%～65%发生早衰；果实成熟盛期（FRS），70%～80%果实成熟，叶片70%～80%发生早衰。分别在同一时期采集不同发育阶段树体上部和下部的叶片，每个阶段各取100 片叶，3 次重复。除营养生长期（VGS），其他阶段仅采集早衰叶片。采下的叶片迅速带回室内，然后依次使用自来水—0.1%洗涤剂溶液—自来水—自来水—0.2%盐酸溶液—蒸馏水—无离子水—无离子水进行漂洗。于105 ℃恒温杀青20 min 后，80 ℃烘至恒质量。然后用不锈钢粉碎机粉碎，使其全部通过0.5 mm 的筛子，放于信封中，置干燥器内于阴凉干燥处保存。

1.3.2 测定方法

氮含量采用凯氏定氮法测定[21]，磷含量采用钼锑钪比色法[22]测定，微量元素含量使用原子吸收分光光度计测定[23]。过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法测定[24]，过氧化氢酶（CAT）活性采用过氧化氢法测定[25]，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑（NBT）光还原法测定[26]。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定[27]。

1.3.3 数据处理

使用Microsoft Excel 2010软件进行数据统计，使用DPS 软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 红树莓不同早衰程度叶片中矿质元素含量

2.1.1 红树莓不同早衰程度叶片中大量矿质元素含量

在同一时期，红树莓不同早衰程度叶片中大量矿质元素含量如图1所示。由图1可见，树体下部叶片氮元素含量变化明显，其变化范围是4.67 ～6.58 g/kg，在营养生长期至果实成熟盛期，氮元素含量下降明显。树体上部叶片磷元素含量变化范围是0.64 ～0.85 g/kg，树体下部叶片磷元素含量变化范围是0.65 ～0.76 g/kg，在营养生长期至果实成熟盛期均下降明显，在果实成熟盛期早衰叶片中维持稳定。树体上、下部叶片钾元素含量变化范围分别是5.47 ～8.68 和5.63 ～8.09 g/kg，在营养生长期至果实成熟盛期均明显下降，正常叶片中钾元素含量显著高于早衰叶片。钙、镁元素含量变化趋势基本相同，在营养生长期至果实成熟盛期均有微幅上涨，树体上、下部叶片钙元素含量的变化范围分别是14.76 ～30.52 和32.52 ～44.58 g/kg，树体上、下部叶片镁元素含量变化范围分别是14.50 ～27.87 和12.71 ～32.91 g/kg，正常叶片中钙、镁含量显著低于早衰叶片（P＜0.05）。

图1 红树莓不同早衰程度叶片中大量矿质元素的含量Fig.1 Changes of large mineral elements in leaves of red raspberry with different degrees of premature senescence in the same period

2.1.2 红树莓不同早衰程度叶片中微量矿质元素含量

在同一时期，红树莓不同早衰程度叶片中微量矿质元素含量如图2所示。由图2可见，铁是红树莓叶片中含量最高的微量元素，树体上、下部叶片中铁元素含量变化范围分别是0.23 ～0.40 和0.25 ～0.42 µg/g，在营养生长期至果实成熟盛期，铁含量呈直线上升趋势。树体上、下部叶片中铜元素含量变化范围分别是0.016 ～0.019 和0.013 ～0.016 mg/g，呈现缓慢下降趋势，在盛花期的早衰叶片中含量降到最低水平0.016 和0.013 mg/g，在果实成熟初期之后表现稳定。锰、锌元素含量变化趋势基本相同，在营养生长期至果实成熟盛期均呈现先下降、后升高、再下降的趋势，树体上、下部叶片锰含量变化范围分别是0.025 ～0.044 和0.025 ～0.048 mg/g，上、下部叶片锌含量变化范围分别是0.032 ～0.048 和0.026 ～0.039 mg/g，正常叶片锰、锌含量显著低于早衰叶片（P＜0.05）。

图2 红树莓不同早衰程度叶片中微量矿质元素的含量Fig.2 Changes of trace mineral elements in leaves of red raspberry with different degrees of premature senescence in the same period

2.2 红树莓不同早衰程度叶片中抗氧化酶活性和MDA 含量

在同一时期，红树莓不同早衰程度叶片中抗氧化酶活性和丙二醛含量如图3所示。由图3可见，不同发育阶段红树莓树体上、下部叶片SOD活性变化较大，呈现先上升、后下降的趋势。在果实成熟初期，树体上、下部叶片SOD 活性均为最高，分别为1.75 和0.50 U/(g·min)；在初花期，树体上、下部叶片SOD 活性均为最低，分别为0.12 和0.29 U/(g·min)。不同发育阶段树体上、下部叶片POD 活性呈先下降、后上升的趋势，在盛花期POD 活性均为最低，分别为8.87 和15.01 U/(g·min)，在果实成熟初期，树体上部叶片POD 活性最高，为29.48 U/(g·min)。不同发育阶段树体上、下部叶片CAT 活性呈下降趋势，在果实成熟盛期，CAT 活性最低，分别为4.43 和17.03 U/(g·min)，在营养生长期，CAT 活性最高，分别为61.83 和31.99 U/(g·min)。不同发育阶段树体上、下部叶片MDA 含量均呈先上升、后下降的趋势，在果实成熟初期，树体上、下部叶片MDA含量最低，分别为5.24 和3.64 µmol/g。

2.3 红树莓早衰叶片中矿质元素含量与抗氧化酶活性及丙二醛含量的关系

在同一时期，红树莓早衰叶片矿质元素含量与抗氧化酶活性及丙二醛含量的相关系数见表1。由表1可知，在78 对指标间的相关关系中有35对达到显著相关，其中呈极显著正相关的有N 含量与Mg 含量，Ca 含量与Mg 含量、Fe 含量、Mn含量、Zn 含量、POD 活性，Mg 含量与Fe 含量、Mn 含量、Zn 含量、POD 活性，Fe 含量与Mn 含量、Zn 含量、POD 活性，Mn 含量与Zn 含量、POD 活性，Cu 含量与SOD 活性、CAT 活性，Zn含量与POD 活性，SOD 活性与CAT 活性。达到极显著负相关的有Ca 含量、Mg 含量、Fe 含量与CAT 活性。这说明在同一时期红树莓叶片不同早衰程度叶片N 含量与Mg 含量，Ca 含量与Mg 含量、Fe 含量、Mn 含量、Zn 含量、POD 活性，Mg含量与Fe 含量、Mn 含量、Zn 含量、POD 活性，Fe 含量与Mn 含量、Zn 含量、POD 活性，Mn 含量与Zn 含量、POD 活性，Cu 含量与SOD 活性、CAT 活性，Zn 含量与POD 活性，SOD 活性与CAT 活性存在着协同作用，而Ca 含量、Mg 含量、Fe 含量与CAT 活性存在着拮抗作用。

图3 红树莓不同早衰程度叶片中抗氧化酶活性和丙二醛含量Fig.3 Changes of antioxidant enzyme activity and malondialdehyde content in leaves of red raspberries with different degrees of premature senescence in the same period

表1 红树莓早衰叶片矿质元素含量与抗氧化酶活性及MDA 含量的相关系数†Table1 Correlation coefficient of leaf mineral elements with antioxidant enzyme activity and MDA content

3 结论与讨论

叶片作为植物最重要的光合器官，为植物的生长发育提供光合同化产物与能量物质[28]。植物叶片衰老是叶片发育的最终阶段，叶片衰老的精准调控对提高植物产量具有积极意义[29]，叶片衰老受外界环境诸多因素的影响[30]。叶片的营养状况与衰老密切相关，研究叶片矿质元素含量的变化规律是进行叶片诊断并确定营养补充方案的重要依据[31]。郭向华等[32]通过对核桃的研究发现，引起叶片早衰的不是单一因素，而是多种矿质元素综合作用的结果。本研究结果表明，在同一时期不同早衰程度红树莓叶片中，矿质元素含量变化明显，营养生长期至果实成熟盛期，正常叶片和早衰叶片中N、P、K、Ca、Mg、Cu、Fe、Mn、Zn 含量差异显著，其中正常叶片N、K、Cu含量显著高于早衰叶片，在果实成熟盛期早衰叶片中P 含量维持稳定，这与滕康利等[33]对核桃树的研究结果一致，正常叶片Ca、Mg、Fe、Mn、Zn 含量显著低于早衰叶片。林添资等[34]通过对水稻的研究发现叶片早衰表型发生在叶龄较早的植株上。本研究结果表明，叶片中N、P、K 等元素的含量在营养生长期后下降明显，此时红树莓正处于快速生长期，要消耗大量养分，因此，营养生长期后是红树莓施肥的关键时期，主要应施N、P、K 肥，这与杨艳等[35]对杨树的研究结果一致。张立新等[36]、张生杰等[37]经研究认为，适量的氮素供应能提高叶片保护酶活性，从而减缓植物的衰老进程。N、P、K 元素是影响植物生长的关键因子[38]，同时，叶片中N、K 含量与叶片早衰程度呈极显著负相关，对早衰发生有至关重要的影响。刘凯等[39]经研究发现，施加Mg 肥能明显增加油桐幼苗相对叶绿素含量，使其生长加快。在本研究中，Ca、Mg、Fe 等元素的含量在营养生长期后明显上升，此时红树莓开始出现早衰现象。

对抗氧化酶活性及丙二醛含量的研究结果表明，营养生长期至果实成熟盛期，叶片中CAT 活性呈下降趋势，正常叶片CAT 活性显著高于早衰叶片，因为CAT 保护酶活性降低，不利于清除植物体内因受外界损伤而产生的活性氧，从而使叶片发生早衰，这与刘霞等[40]的研究结果一致。叶片中POD 活性和MDA 含量呈先下降、后上升的趋势，整体来看，正常叶片POD 活性和MDA 含量均低于早衰叶片。果实成熟初期，上、下部叶片SOD 活性均为最大值，此时果实开始成熟，SOD 活性达到最大，这与杨淑慎等[41]的研究结果一致。叶片中抗氧化酶活性与矿质元素含量有着密切的联系[42]。在叶片矿质元素含量与抗氧化酶活性及丙二醛含量的相关性分析中可以发现，Ca、Mg、Fe 含量与SOD 活性、MDA 含量无相关性，Ca、Mg、Fe 含量与POD 活性存在协同作用，Ca、Mg、Fe 含量与CAT 活性均存在拮抗作用。早衰叶片中CAT 活性降低，POD 活性升高，Ca、Mg 和Fe 含量均上升。因此，为降低叶片发生早衰现象，应减少Ca、Mg、Fe 肥的施用。

本试验结果是在一定的栽培管理条件下得出的，红树莓在我国栽培范围广泛，地理环境、土壤肥力有明显差异，不同品种或栽培方式的红树莓发生早衰现象的原因也有所不同，此外，红树莓的栽培管理，还应充分考虑自然条件、品种特性、树体情况、水肥状况等因素的影响[43-45]。因此，在实际生产应用中，为解决红树莓早衰现象，还应在此试验结果基础上，根据当地气候、人为管理等条件进行相应调整。