耳鸣机制中相关蛋白表达的研究△

王瑾瑜 韩朝

[复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科 上海市听觉医学临床中心 国家卫生健康委员会听觉医学重点实验室(复旦大学) 上海 200031]

目前耳鸣的发生机制仍不清楚，有关耳鸣形成机制的假说有很多，在大多数情况下，耳鸣产生可能的诱因有外周听觉系统损害引起的脑干、皮质下或大脑皮质水平异常兴奋性[1]。基于目前研究的成果，国内外学者普遍认为主观性耳鸣可能起源于外周，而发展和维持于中枢，是由于中枢的重塑，也就是听力损伤后所继发的听觉皮质异常适应性改变的结果。可塑性是脑的主要特征之一，是指大脑对感觉输入的改变进行反应，神经重塑可以通过改变神经信息处理和信息通路重建来实现，引起相应的症状。这个现象的基础可能源于某些神经结构的变化，与不同的中枢参与有关系，如各个中枢直接的连接或者新神经环路的建立，而促成这些结构建立的分子机制可能是与某些蛋白的表达有关。以下就常见的动物耳鸣模型中相关脑区蛋白水平的变化进行分类讨论。

1 噪声损伤诱发耳鸣引起的蛋白水平变化

听力下降会导致中枢听觉通路的变化，包括频率分布图重组和初级听觉皮质神经元放电率增加，后者可能通过神经重塑机制促发异常的同步网络行为，从而产生耳鸣[2]。耳鸣的感觉伴随着听皮质的活动增加。苏文玲等[3]对耳鸣大鼠大脑的扫描发现，与对照组比较，中枢听觉通路的活动性发生了改变，在脑干和中脑活动性降低，而听觉皮质的活动性增加。这种听觉皮质兴奋性的持续存在，可能导致听觉皮质神经元发生改变。耳鸣大鼠听觉皮质中神经元功能可塑性基因生长相关蛋白(growth associated protein-43，GAP-43)和细胞骨架活性调节蛋白(activity regulated cytoskeleton associated protein, ARC)的表达增加，推测他们可能在耳鸣的发生、发展中起重要作用，因为GAP-43的表达与轴突的生长一致，是一种成熟的轴突生长和突触生成的标记物。ARC是一种细胞骨架活性调节蛋白，可以改变神经元的兴奋性和可塑性。GAP-43和ARC的表达水平能够反映中枢神经系统功能活动的变化，被普遍认为与中枢神经系统的功能可塑性有关[3]。

1.1 GAP-43 GAP-43的表达可用于评估耳蜗核中的神经可塑性，通常认为听觉通路中的异常损害导致的神经可塑性变化可能与耳鸣的感知有关。噪声导致的耳蜗损害可以导致广泛的纤维增生和耳蜗核中的突触生长，研究发现这些改变与耳鸣有关[2]。Kraus等[2]将9只大鼠暴露在窄带噪声后，通过间隙前脉冲声惊吓抑制(gap prepulse inhibition of the acoustic startle,GPIAS)对噪声暴露后的老鼠与3只未进行噪声暴露的年龄匹配对照组进行耳鸣样行为筛查，全部9只暴露于噪声下的大鼠暴露侧耳区域在高频和中频时表现出相似的严重毛细胞损失。9只大鼠中的8只在内侧腹侧耳蜗核(ventral cochlear nucleus，VCN)中表现出GAP-43的大幅上升。并且在噪声暴露后无耳鸣大鼠比暴露后有耳鸣大鼠在VCN中表现出更多的GAP-43表达。这一现象提示听觉神经变性在耳鸣的产生中起作用，可能是强烈的突触生长抑制了耳鸣的发展，即突触可塑性改变了神经元连接性，使得它不再产生耳鸣。由此产生的神经元连接或突触效率的变化可以抑制耳蜗核或其他中枢听觉区域中耳鸣相关的活动过度。另一种解释为耳鸣可能抑制听觉可塑性和GAP-43表达。综上结果表明，噪声诱导的耳鸣会引起内侧VCN中GAP-43的大幅上调，并被蛋白水平的变化反向抑制。同时，对VCN中抑制性神经元的兴奋输入增加可能会减少中枢活动过度和耳鸣[2,4]。

1.2 ARC Kapolowicz等[5]评估了创伤性噪声暴露后早期的神经可塑性变化与耳鸣的关系以及涉及的相关神经元机制。噪声损伤是导致耳鸣的常见原因之一，将雄性大鼠双侧耳暴露于足以引起急性耳蜗创伤并诱发大鼠耳鸣的急性高强度噪声中45 min，通过Western印迹分析发现，杏仁-海马环路中ARC表达的上调在噪音创伤后早期迅速发生，这表明大脑边缘结构在耳鸣发生早期表现出神经可塑性[5]。同时对比暴露在非创伤性噪声中，在这些大脑区域中并未出现ARC表达的上调。可以推测ARC作为一种神经可塑性的生物标记可能与创伤性噪声所致耳鸣的早期神经可塑性有关。同时Western印迹分析显示，噪声和谷氨酸脱羧酶(GAD，GABA抑制能合成所需的生物酶)在杏仁核 - 海马中的表达无关[5]。尽管目前的研究中没有观察到GAD表达的变化，但仍应进一步考虑抑制性神经传递过程中的潜在变化。环丝氨酸(dcycloserine，DCS)是离子型受体N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)的一种激动剂，被认为有减少或预防噪声创伤引起的耳鸣相关可塑性变化的能力。有学者对此进行测试，表明DCS的迅速全身给药可以预防创伤性噪声诱导的杏仁核中ARC蛋白表达的上调，但海马中没有此种变化，这表明仅仅通过DCS不能完全有效地消除噪声创伤后特定区域的早期可塑性变化[5]。Davis等[6]证明了DCS治疗在临床治疗耳鸣中的有效性。

2 水杨酸盐诱发耳鸣引起的蛋白水平变化

2.1 离子型谷氨酸受体NMDAR及亚型 兴奋性及抑制性氨基酸可能与神经可塑性有关，兴奋和抑制传入引起听觉通路中神经元活动的失平衡可能是导致耳鸣的重要原因之一[7]。广泛分布在听觉系统中的谷氨酸是中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质。Potashner 等[8]发现单侧耳蜗损毁后，耳蜗核、橄榄耳蜗束以及中脑等组织中谷氨酸能神经递质释放增加，并可能与听力损失和耳鸣有关，在神经系统的突触可塑性中发挥着重要作用。谷氨酸受体中NMDAR是一种分布在突触后膜上的离子通道蛋白，其功能主要参与发育过程中神经回路的细化及触发多种形式的突触可塑性[9]。Sahley 等[10]发现在高压力时期耳蜗Ⅰ类听觉神经元树突内生强啡肽介导的谷氨酸兴奋性中毒，会使主观慢性神经性耳鸣恶化，其可能的机制为水杨酸盐通过增强谷氨酸对耳蜗中NMDAR的作用引起的一种急性的兴奋性中毒，导致耳蜗Ⅰ类听觉神经中枢性耳鸣。NMDAR的活化在感觉经验控制或影响的突触可塑性中起重要作用。在水杨酸引起耳鸣的机制中，Guitton等[11]开发了一种大鼠耳鸣测定的行为模型，给予水杨酸盐导致大鼠行为正确反应百分比的降低和假阳性反应(大鼠表现的像是听到了声音即耳鸣从而产生行为)数量的急剧增加表示大鼠产生耳鸣。水杨酸盐耳毒性的生理学基础可能源于花生四烯酸代谢的改变，水杨酸盐能抑制耳蜗环氧酶，从而导致花生四烯酸的水平提高，而因为花生四烯酸会增强NMDAR电流，Guitton等[11]通过在耳蜗外淋巴液中应用NMDA拮抗剂阻断了水杨酸盐诱导的跳跃行为的增加，来测试耳蜗NMDAR在耳鸣发生中的参与，表明水杨酸盐可能通过激活耳蜗NMDAR诱导耳鸣。而后有研究表明，大鼠听觉皮质的正常发育同时与上述NMDAR的亚型NR2A的表达升高有关。贾明辉等[12]通过注射水杨酸钠制造大鼠耳鸣模型并用行为学方法证实动物感受到耳鸣后，切片染色观察发现NR2A表达增多，表明注射水杨酸钠后大鼠听觉皮质中发生了与耳鸣相关的突触可塑性进程。同时，NMDAR参与了可塑性的方方面面，NR2B是NMDAR的一种亚基，定位于耳蜗核中的前脑、海马区、大脑皮质、纹状体、丘脑等区域，Hu等[13]发现长期注射水杨酸盐导致耳鸣后，耳蜗核中NR2B的mRNA和蛋白表达明显增加，NR2B的上调增加了电荷转移和Ca2+内流，这可能有助于增加耳蜗核中兴奋性神经递质的水平，同时他们发现，NR2B水平的改变是可逆的，即停止注射水杨酸盐以后，NR2B的表达可以恢复到原来的水平。

2.2 c-fos蛋白 研究发现在耳鸣大鼠听觉皮质中神经元功能可塑性标记物即刻反应基因c-fos的表达产物c-fos蛋白表达增加[12，14]。c-fos能够反映中枢神经系统功能活动的变化，是细胞分辨脑活动的有价值指标，被普遍认为与中枢神经系统的功能可塑性有关，c-fos蛋白主要存在于皮质神经元的胞核。c-fos蛋白表达的增多反映了耳鸣大鼠听觉皮质神经元的异常电活动和功能可塑性变化。c-fos蛋白和NR2A表达的增加不但说明神经递质及受体参与了耳鸣的发生，同时反映了耳鸣动物听觉皮质中神经电活动的异常与功能可塑性改变，而发生于声音感知最高级中枢的这些变化可能在耳鸣的发生、发展及转归中具有更为重要的作用[12]。Wallhäusserfranke等[14]将沙鼠暴露在脉冲噪声制造耳鸣模型后，发现c-fos在大脑听皮质和耳蜗背侧核中表达增加。同时他们对沙鼠进行水杨酸盐注射和噪声暴露，进行2种处理后，发现c-fos在杏仁核，丘脑中线、层内，额叶皮质，下丘脑以及脑干中与行为和生理防御反应有关的非听觉区域中表达增加，这些非听觉区域的激活可能与耳鸣的急性应激有关。

2.3 Ca2+/CaMKⅡ/CREB 突触后Ca2+是重要的第二信使，Ca2+信号通路操控细胞生长、分化并和突触可塑性有关。钙调蛋白(calmodulin，CaM)是主要的Ca2+结合蛋白，调控神经元的功能。Ca2+与CaM结合形成复合物后通过磷酸化激活钙调蛋白激酶Ⅱ(calcium-calmodulin kinase Ⅱ，CaMKⅡ)。Ca2+和CaMKⅡ是中枢神经系统兴奋性突触可塑性的关键介质，环磷腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)是 CaMKⅡ的下游分子之一，它的激活可以促进多种突触可塑性相关蛋白的表达。Zhao等[15]通过用水杨酸诱导Wistar大鼠耳鸣模型研究发现，耳鸣组大鼠听皮质中CaM, CaMKⅡ ，CREB的表达水平显著上调。这表明水杨酸会引起大鼠耳鸣的症状，并提高听觉皮质细胞Ca2+/ CaMKⅡ/CREB信号通路的表达。该研究表明大鼠耳鸣的发生与Ca2+/ CaMKⅡ/CREB信号通路的变化有关。

2.4 大鼠海马区促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin-releasing factor，CRF) CRF是一种情绪应激相关蛋白，存在于与情绪相关的脑区，与应激、情绪、学习和记忆等 行为活动密切相关。解为全等[16]实验研究发现，给大鼠注射水杨酸钠后，通过Western印迹方法检测到耳鸣大鼠的海马区CRF表达增强，且随注射时间延长其表达量增加，提示CRF表达升高可能是边缘系统参与耳鸣的重要机制之一,可能在耳鸣引起负性情绪和大脑海马区对耳鸣的病理性记忆中起重要作用。

2.5 RIBEYE RIBEYE是带状突触上所知唯一的结构蛋白，它与内毛细胞的正常结构和功能的维持以及带状突触发生有关，并通过影响传入神经的神经支配和影响毛细胞活性区域中的Ca2+通道来维持耳蜗的正常声学和前庭功能[17]。Schmitz等[18]在视网膜中部分纯化了带状突触，并鉴定出一种叫做RIBEYE的主要蛋白质成分，并表明RIBEYE在脊椎动物中利用先前存在的蛋白质为特定的突触构建独特的支架。Zhang等[19]通过研究水杨酸盐诱导的耳鸣中耳蜗内毛细胞中突触带和RIBEYE表达的变化来探讨耳鸣的机制。给C57BL / 6J小鼠注射水杨酸10 d后，通过RT-PCR和Western印迹试验检测发现RIBEYE的mRNA和蛋白质的表达先上调后下降。他们认为水杨酸盐诱导小鼠耳蜗内毛细胞带状突触表达的这种变化趋势可能在耳毒性的早期阶段起到代偿机制的作用，并在以后导致耳鸣，RIBEYE表达的改变可能是导致带状突触形态和水杨酸盐诱导耳鸣变化的原因。

2.6 脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF) BDNF是神经存活分化，皮质发育，突触效能及结构改变和中枢听觉神经可塑性中的关键因子，属于生长因子的神经营养因子家族，通过特异性受体起作用，维持神经发生和已存在神经元的存活，增强了突触的形成。Yi 等[20]发现长期应用水杨酸可以通过影响BDNF、BDNF前体(pro-BDNF，相比于成熟BDNF，对神经元结构和突触可塑性有相反的影响)、酪氨酸激酶受体B ( tyrosine kinase receptor B,TrkB)，cAMP反应元件结合蛋白CREB，听觉皮质中的磷酸化CREB(p-CREB)水平的表达而导致耳鸣的产生。长期应用水杨酸盐大鼠，听觉皮质中BDNF的表达水平上调；激活CREB，p-CREB的表达水平提高，提升突触有效性，并伴有超微结构突触改变，提高突触效能，增强神经递质释放，增加PSD支架和突触泡蛋白的合成。BDNF的变化，听皮质中的BDNF-TrkB-CREB信号通路可能与耳鸣相关。所有这些变化同时意味着长期应用水杨酸盐可显著地引起听皮质水平的神经可塑性变化，这可能在持续性耳鸣中起着至关重要的作用，也为今后基于BDNF的耳鸣治疗策略提供了新思路。

3 外周情绪相关耳鸣蛋白

3.1 细胞因子 细胞因子在细胞、组织和系统之间的交流中发挥重要作用，首先作为免疫防御的一部分被发现，但很快就发现在其他系统中也可以产生。在炎症过程中，会产生一系列促炎细胞因子，包括白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)，白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子-α( tumor necrosis factor-α，TNF-α)和干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等。Szczepek[21]研究认为测量循环细胞因子的浓度可能成为未来耳鸣诊断的另一个客观生物学标记并且与耳鸣引起的痛苦有关。细胞因子是由多种细胞产生和分泌的可溶性肽、蛋白质或糖蛋白。Henry等[22]发现在一些人中，耳鸣引起的听觉皮质激活可能触发到边缘和营养网络的信号并引起所谓的“耳鸣相关的痛苦”。耳鸣相关的痛苦是复杂的，表现为听觉注意力集中在耳鸣的声音上，增加了心理包括躯体不适的情绪。这些可以使用心理测量仪器进行测量。通过诊断为慢性耳鸣的患者血清中细胞因子的浓度和当日的心理测量分数发现， TNF-α和IL-1β具有作为耳鸣相关疼痛生物标记物的潜在作用，相关性分析检测到TNF-α的浓度与耳鸣响度，总感知压力，紧张和抑郁之间存在显着正相关，并且TNF-α与心理测量评分“joy”之间存在着负相关。IL-1β的浓度与耳鸣的感知等级相关。而IL-6与耳鸣的相关性不大，此外听力受损程度或纯音听阈和循环细胞因子浓度之间没有相关性。Chen 等[23]对慢性耳鸣刺激后细胞因子的异常调节进行了研究，用水杨酸盐对大鼠进行长期慢性耳鸣造模后，通过GPIAS可检测出大鼠出现耳鸣样行为，并且耳鸣大鼠听觉皮质中TNF-α基因表达上升，与此同时，IFN-γ基因表达下降，而IL-6基因表达并没有改变，通过这些数据可得出水杨酸致耳鸣后会导致听皮质中细胞因子的异常调节。

综上所述，耳鸣的发生、发展中与不同的蛋白表达以及水平改变有关，本文总结了与耳鸣相关蛋白在不同原因耳鸣造模后的表达位置和表达水平变化(表1)。多方面研究提示，不同原因引起的耳鸣中枢机制中各个环节中均有不同蛋白的参与，同时可以发现通过噪声诱导和水杨酸盐诱导耳鸣造模过程中，会有相同蛋白的参与，如GAP-43和ARC 2种表达水平能够反映中枢神经系统功能活动的变化的蛋白质[2-3]，这可能表明2种造模过程中都存在听觉皮质的神经重塑过程。通过对各种蛋白的监测和研究，有助于为耳鸣的基础研究和临床治疗提供新的靶点和思路。

表1 耳鸣相关蛋白的诱因分类、表达位置以及表达水平变化