IVIM在预测高级别脑胶质瘤MGMT启动子甲基化状态的应用价值

田博闻，杨国强，秦江波，张辉*

脑胶质瘤是具有异质性的一种中枢神经系统肿瘤，其组织学和预后存在很大差异[1]，对于高级别的脑胶质瘤患者，手术切除联合放化疗是标准的治疗方法，而目前最常用的化疗靶向药物就是替莫唑胺[2]。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)是一种DNA修复酶，参与了细胞防御诱变和烷基化剂毒性修复的过程，导致肿瘤对烷基化剂产生抗药性，而MGMT启动子的甲基化在表观遗传学上使MGMT基因沉默，提高肿瘤对烷基化试剂的敏感性[3]，因此携带MGMT启动子甲基化的脑胶质瘤患者在化疗后总体生存期和病情进展时间均有所增加[4]，但是目前的实验室检测主要依赖于基因分析方法，需要通过活检或手术切除获得肿瘤组织，而基因检测受到了检测费用昂贵、检测周期长以及肿瘤异质性的约束[5]，因此术前无创性地对MGMT启动子甲基化状态进行预测对于患者预后的评估以及个性化治疗方案的选取有重要的临床意义[6-7]。

扩散和灌注磁共振成像常用于肿瘤组织的定性和治疗反应的评估[8]，体素内不相干运动(intravoxel incoherent motion，IVIM)成像是一种从多个b值的扩散加权图像中分离定量微血管灌注信息的方法，可以在无需对比剂的情况下更准确地反映肿瘤的微环境[9]，本研究旨在探讨IVIM各参数对高级别脑胶质瘤MGMT启动子甲基化状态的预测价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

回顾性收集2016年10至2019年6月在山西医科大学第一医院病理确诊为原发性高级别脑胶质瘤的患者34例，其中MGMT启动子甲基化组19例和MGMT启动子非甲基化组15例。纳入标准：(1)经组织病理学证实为WHO Ⅲ～Ⅳ级原发性脑胶质瘤的患者；(2)术前均行常规MRI平扫、增强扫描及IVIM序列扫描检查；(3)使用焦磷酸测序法检测MGMT启动子甲基化状态并获得准确结果。排除标准：(1)患者在MRI采集和手术前进行放化疗或其他治疗；(2)图像伪影严重，影响参数的测量。研究的设计和方案已获得山西医科大学第一医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 图像采集

所有的MRI数据都是使用GE 3.0 T磁共振成像和头颈关节八通道相控阵线圈扫描。IVIM扫描和增强扫描均在相同条件下进行。T1WI增强扫描参数：TR 2002.20 ms，TE 24.20 ms，层厚6.0 mm，FOV 24 cm×24 cm；IVIM-DWI的平面回波序列(echo-planar imaging，EPI)扫描参数如下：TR 6550 ms，TE 116 ms，层厚6.0 mm，NEX为3，FOV 24 cm×24 cm，矩阵128×128，层间距为1.0 mm。选取的13个b值分别为：0、20、50、100、200、400、800、1200、1800、2500、3000、3500、4000 s/mm2。

1.3 MGMT启动子甲基化状态的测定

使用焦磷酸测序法测定患者肿瘤细胞的MGMT启动子甲基化状态，使用Simlex-OUP®FFPE DNA提取试剂盒(TIB，中国)从冷冻肿瘤组织中提取DNA，然后使用NanoDrop 2000 (Thermofisher，美国)分光光度法进行定量，使用外延亚硫酸氢钠试剂盒(Qiagen，德国)进行硫酸氢钠改性。之后采用PCR结合热标记Q96系统(Qiagen，德国)在10个CpG岛进行热测序MGMT启动子内的区域。如果CpG区域的平均甲基化率≥8%，脑胶质瘤被定义为甲基化，否则肿瘤被认为是非甲基化[8]。

1.4 定量参数测量及肿瘤分割

将原始图像传输到工作站(advantage workstation 4.4，GE医疗系统)，采用Functool工具包中的MADC软件对图像进行后处理分析。分别获得IVIM各参数：真扩散系数(true diffusion coefficient，D)、灌注相关扩散系数(perfusion related diffusion coefficient，D*)、灌注分数(perfusion fraction，f)的伪彩图，肿瘤组织的感兴趣区域(region of interest，ROI)由2名资深的影像科医师分别参照同层面轴位增强T1WI所示强化最大区域(避开囊变、出血等)手动勾画，ROI大小约40～60 mm2，在最大层面及相邻上下层面测量三次取平均值。为了避免个体差异带来的误差，将肿瘤实质区各参数平均值除以对侧正常脑实质区平均值，计算得到校正后参数值：rD (relative D)、rD*(relative D*)、rf (relative f)。

1.5 统计学方法

分析数据使用统计软件SPSS 22.0，结果采用平均值±标准差表示，然后测试获得数据的正态性。在校正参数定量分析中，采用组内相关系数(intraclass correlation coefficient，ICC)来评价2名观察者之间的一致性，当ICC值＞0.75时则表示信度良好。对于符合正态分布的数据，使用两独立样本t检验进行分析，如果不符合正态分布，则使用秩和检验进行分析，检验rD、rD*、rf在MGMT启动子甲基化组与非甲基化组间的差异性，对具有统计学意义(P＜0.05)的参数，进一步绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线，用曲线下面积、灵敏度、特异性和相应的最佳分界阈值，评估各参数的诊断性能。

2 结果

2.1 临床特征分析

本次研究共收集高级别脑脑胶质瘤患者34例，其中WHO Ⅲ级(19例)，Ⅳ级(15例)，MGMT启动子甲基化率为55.9%(19/34)，Ⅲ级甲基化率57.9%(11/19)，Ⅳ级甲基化率53.3%(8/15)。性别比例:甲基化组19例(男11例，女8例)，非甲基化组15例(男8例，女7例)。平均年龄：甲基化组(48.73±12.13)岁，非甲基化组(52.68±12.69)岁，各组间年龄、性别以及MGMT启动子甲基化在Ⅲ、Ⅳ级的分布差异均无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 观察者一致性分析

观察者间测量各校正参数的一致性良好，其中rD的观察者间ICC值为0.914 (95% CI：0.824～0.948)；rD*的观察者间ICC值为0.921 (95% CI：0.845～0.954)；rf 的观察者间ICC值为0.897 (95% CI：0.818～0.925)。

2.3 影像参数分析

高级别脑胶质瘤中MGMT启动子甲基化组中rD、rf值高于非甲基化组，rD*值低于非甲基化组，差异均有统计学意义(P＜0.05)(表1)。各模型所得参数ROC曲线及诊断效能见表2和图1、2。

表1 不同MGMT启动子甲基化状态的高级别脑胶质瘤IVIM参数比较Tab. 1 Comparison of IVIM parameters of high-grade gliomas with different MGMT promoter methylation status

表2 IVIM参数对MGMT启动子甲基化状态的诊断效能Tab. 2 Diagnostic efficacy of IVIM parameters on methylation status of MGMT promoter

3 讨论

3.1 IVIM参数的原理及意义

磁共振扩散加权成像(diffusion weighted imaging，DWI)使用水分子作为内源性对比剂来评估肿瘤的扩散率和组织微结构，随着磁共振(magnetic resonance，MR)设备的不断发展及对DWI研究的深入，通过设置较大范围内多个b值进行DWI扫描，并基于双指数模型可以分离水分子运动相关的扩散及灌注参数，有助于更好的分析组织特征和治疗监测。大量文献报道，当b值＜200 s/mm2且大于4个时能更有效准确地反映灌注相关信息[10-11]。关于IVIM参数的生理基础，有学者认为D、D*和f分别对应组织扩散率、毛细血管血流速度和毛细血管血流的分数体积，根据灌注分数乘以灌注相关扩散系数的乘积可以估算出灌注量[9，12]。

3.2 扩散参数的相关分析

本研究表明MGMT启动子甲基化组较非甲基化组有更高的rD值，并且有统计学意义，这与Moon等[13]的研究结果相同，高的rD值表示甲基化组的肿瘤细胞密度低，细胞间隙大以及水分子扩散受限程度更轻。推测可能的原因是MGMT是一个人体正常存在的自我修复蛋白，可以防止细胞内基因突变，进而细胞凋亡的一种修复酶。而MGMT启动子甲基化后，沉默了MGMT基因的启动序列，使其处于停滞状态无法正常转录翻译，导致细胞中的MGMT蛋白合成减少，损伤和突变的基因序列不能被MGMT蛋白修复而变形失活，导致肿瘤细胞凋亡[14]。也有研究表明MGMT启动子甲基化会增加DNA的不稳定性，使得DNA更容易发生突变和裂解，进而导致细胞的凋亡，所以MGMT启动子甲基化的肿瘤细胞密度更小，rD值更高，提示其具有更好地预后。此外Rundle-Thiele等[15]对于胶质母细胞瘤的患者做了进一步的研究，他们使用直方图统计法对数据进行分析，得出的结果是MGMT启动子甲基化组的肿瘤细胞具有更低的扩散参数，水分子扩散受限程度更重，与本研究结果不同，这可能是由于方法的不同所导致，包括ROI的选择、统计分析和不同的分组(高级别胶质瘤和胶质母细胞瘤)。

3.3 灌注参数的相关分析

MGMT启动子甲基化组与非甲基化组相比，出现了rD*值的降低和rf值的升高。rD*与肿瘤内毛细血管的生成及血流量有关，表示MGMT启动子甲基化组较非甲基化组有更低的灌注，与Ryoo等[16]的研究结果一致，说明在甲基化组中微循环灌注更低，毛细血管生成更少，提示肿瘤具有更弱的侵袭性。Chahal等[17]认为，MGMT参与了肿瘤的发生与进展，MGMT阳性细胞的血管内皮生长因子受体水平较高，而血管内皮生长因子与受体的结合能促进内皮细胞的增殖与存活，从而加速了肿瘤血管的生成与发育，所以当MGMT启动子甲基化后使得MGMT基因沉默，减少了肿瘤内血管的生成，进而解释了甲基化组的肿瘤内毛细血管的生成减少，血流量降低，rD*值降低原因。

MGMT启动子甲基化组较非甲基化组有较高的f值，提示其具有更高的灌注占比，有研究表明，f值与动态对比增强磁共振成像(dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging，DCE-MRI)中的容积转运常数(volume transfer constant，Ktrans)值有强相关性[18]，预示着两者机制之间有相似之处，Ktrans值是表示微血管通透性相关参数。而AHN等研究发现，MGMT启动子甲基化组有更高的Ktrans值，可能是由于Ktrans值增加意味着替莫唑胺更容易渗透，从而导致治疗成功率的增加以及更好的预后表现[19]，所以笔者认为f值的升高可能是由于在同等灌注下，MGMT启动子甲基化组具有更高的毛细血管通透性，导致其灌注分数升高，表示其具有更高的血药交换率，这与也与临床上研究的甲基化组的肿瘤对替莫唑胺有更高的敏感性一致，还有研究表明在高级别脑胶质瘤中高Ktrans值患者的生存期更长[20]，因此f值对脑胶质瘤患者生存期的预测也有重大的潜力。

然而，这项研究仍有一些局限性，主要包括以下几点：(1)研究中心为单中心且样本规模小不具有代表性；(2)感兴趣区的划取和肿瘤标本的切片区域不符合，导致的空间异质性带来的误差；(3)多b值的选取也不是最佳选择。

综上所述，IVIM能无创评估脑胶质瘤MGMT启动子甲基化状态，其中rD*的灵敏度较高，有助于指导高级别脑胶质瘤患者的个性化诊治方案以及对预后的评估。

利益冲突：无。