高效毛细管电泳法同时检测饲料中四种镇静类药物

王 涛，韩 芸，滑鹏敏，张 伟，韩 旭

(河北省产品质量安全检测技术中心，河北 石家庄 050051)

2002年2月，农业部发布了《禁止在饲料和动物饮水中使用的药物品种目录》(农业部公告第176号)，目录中规定了禁止在饲料中添加的精神药品包括苯巴比妥、艾司唑仑、地西泮、盐酸氯丙嗪等。近年来，一些养殖户仍然在饲料中添加入这些国家明文禁止使用的镇静类药物，使用这些药物可以影响动物正常的生理代谢功能，导致动物嗜睡且快速增长，但这些药物可以在动物体内积蓄，人类吃了这种积蓄了镇静类药物的动物以后，身体健康就会受到一定程度的影响。因此，对饲料中是否含有镇静类药物的检测显得尤为重要。

对饲料添加剂的检测，目前，我国主要采用传统的溶剂萃取、液液分配、柱层析净化等技术。采用这些技术进行检测，不仅自动化程度低，提取净化效率不高，检测速度慢，而且由于大量使用有机溶剂导致对环境的污染比较严重的。

经过长达5年的研究，我们利用高效毛细管电泳法实现了对苯巴比妥，艾司唑仑、地西泮和盐酸氯丙嗪等镇静类药物的快速检测和同时检测，可以连续自动进样及在线分析，能够应用于大批量样品的测定，精确度优于高效液相色谱法(HPLC法)。而且分离过程所用溶液大多为盐类的缓冲液，与常用的液相色谱法分离方法比较，减少了有机化学试剂的使用，降低了对实验室仪器操作人员的危害，同时也减少了对环境的污染。本实验分别从缓冲液种类及pH值、表面活性剂SDS的浓度、添加剂、毛细管长度、检测波长等几个方面分析，选择合适的检测条件，最终获得了苯巴比妥，艾司唑仑、地西泮和盐酸氯丙嗪四种物质的高效检测。

1 材料与方法

1.1 仪器

毛细管电泳仪、分析天平、旋涡混合器、电动离心沉淀器、超纯水机、超声波清洗器、恒温水浴锅等。

1.2 试剂

苯巴比妥、艾司唑仑、地西泮、盐酸氯丙嗪、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲醇、乙腈、冰醋酸、正已烷、盐酸、氢氧化钠等，均为分析纯。

1.3 样品处理

将饲料磨碎，然后用2.8mm孔筛筛分，称取磨碎后的饲料2g，放于50ml离心管中，加入乙腈30ml，超声30min，再以3000转/min的速度离心5min，取上清液蒸干，用4ml浓度为2%的乙酸溶液溶解，混匀，加入2ml正已烷，涡动30s-60s，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤后蒸干，最后加入PH8.6的磷酸盐缓冲液定容到1.00ml。

1.4 电泳条件

柱长：37cm，柱温：25℃，工作电压：18kV，检测波长：257nm，缓冲液体系的pH值：8.60[1]。

2 结果与讨论

2.1 缓冲液种类及pH值的选择

缓冲液种类及pH值的选择，是以待测物的性质以及分离效率为依据确定的，是分离成败的关键因素之一。缓冲液的pH值直接影响到组分的存在形式、解离程度、质子化程度等,进而决定了组分的淌度和体系的电渗流。pH值的选择应以待测物的pKa值为依据[2]。苯巴比妥的pKa值为7.4，艾司唑仑的pKa值为2.84，地西泮的pKa值为3.4，盐酸氯丙嗪的pKa值为9.3。本实验选择了磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液，同时调试不同pH值进行组合实验测试，经过实验发现，当采用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液且pH值为8.6进行测试时，这四种镇静类药物均发生电离，能够得到四个峰的电泳图，且分离效果较好。

2.2 表面活性剂SDS的浓度选择

SDS，即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子表面活性剂，在电泳技术中应用十分广泛。表面活性剂浓度对组分的分离度以及迁移时间有着重要的影响。组分的迁移时间随着 SDS 的浓度增加而增加,根据多次实验测试，SDS浓度为15 mmol/L时效果最佳。

2.3 添加剂的选择

常用添加剂为有机溶剂，一般选用乙睛、甲醇、异丙醇等，浓度一般为5%～20%。加入有机溶剂后,可以使一些较难分离的化合物得到分离，但随着添加剂浓度的增加，迁移时间会明显延长。同时，我们又考虑了安全环保因素，最终选择了7.5% 的甲醇作为添加剂。

2.4 毛细管长度的选择

我们分别选择了27cm、37cm、47cm、57 cm 的毛细管进样, 测试发现，测试发现，随着毛细管长度的增加,分离时间相应增加,电流相应减少。因此，我们选择了37cm的毛细管。

2.5 检测波长的选择

我们选择了220nm、240nm、257nm、268nm、284nm等不同的波长进行测试，测试发现，当波长为257nm时，苯巴比妥、艾司唑仑、地西泮、盐酸氯丙嗪这四种镇静类药物均有很高的紫外吸收，且有较好的灵敏度，因此，我们选择257nm作为检测波长。

2.6 线性关系和检测限

配制系列浓度的四种镇静剂类药物的标准溶液，在选定的最佳电泳条件下进行对照实验、线性关系和检测限的实验，验证了方法的准确性、可靠性，能够满足饲料类产品中镇静剂类药物的检测要求，检测结果见表1。从表1可以看出，苯巴比妥、艾司唑仑、盐酸氯丙嗪的线性范围均为5～50μg/ml，地西泮的线性范围为10～50μg/ml，线性相关系数≥0.9479。苯巴比妥、艾司唑仑、盐酸氯丙嗪的检测限为2mg/kg，地西泮的检测限为5mg/kg。

表1 线性关系和检测限(n=6)

2.7 样品检测

将饲料样品按照上述条件进行样品处理和检测，检测结果见表2。

表2 各组分浓度与峰面积关系

出峰顺序分别为：t苯巴比妥=3.54min；t艾司唑仑=7.31min；t地西泮=8.17min；t盐酸氯丙嗪=10.04min。

2.8 方法的回收率及精密度实验

对饲料样品进行不同浓度水平的加标回收率及精密度试验，测定结果见表 3。从表3可以看出，被测样品回收率为 67.5%～98.2%，精密度为5.7%～12.3%。

表3 回收率及精密度试验(n=6)

3 小结

本实验在弱碱性条件下同时快速检测饲料中苯巴比妥、艾司唑仑、地西泮、盐酸氯丙嗪四种镇静类药物，在11min内可以实现分离检测，苯巴比妥、艾司唑仑、盐酸氯丙嗪的线性范围均为5～50μg/ml，地西泮的线性范围为10～50μg/ml，线性相关系数≥0.9479。苯巴比妥、艾司唑仑、盐酸氯丙嗪的检测限为2mg/kg，地西泮的检测限为5mg/kg，样品回收率为67.5%～98.2%，精密度为5.7%～12.3%。

将高效毛细管电泳法用于饲料中镇静类药物的检测，为饲料产品质量安全检测提供了快速、高效的检测方法，有利于提高饲料产品的安全性，对促进饲料行业的健康发展，保障畜牧类产品质量安全，维护公众健康，促进畜牧行业高质量发展具有重要意义。