白桦脂醇对人胃癌MGC-803细胞增殖的抑制作用和凋亡诱导作用①

张 玉 李延玲 李书印 李 进 (南阳医学高等专科学校第一附属医院全科医学，南阳 473058)

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，严重威胁人类健康。我国是胃癌高发国家，其发病率和死亡率分别占全世界的42.6%和45%。对于处于早期的胃癌，手术切除能取得较好的治疗效果。但胃癌起病隐匿，早期症状和体征不明显，导致多数患者初次诊断时已经处于晚期。晚期胃癌多已发生肝脏、腹膜、周围脏器和淋巴远端转移，难以实施手术治疗。化疗治疗处于转移期胃癌的主要作用是改善患者生活质量和延长生存期，且具有较大的毒副作用。曲妥珠单抗和贝伐单抗等靶向药价格昂贵且临床应用需综合考量，因此寻找高效低毒且来源广泛的治疗药物具有重要意义。近年来白桦树皮的药理作用受到广泛关注，其提取物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降脂、利胆保肝等作用[1]。白桦脂醇是白桦皮中提取的羽扇烷型三萜类化合物，是白桦树皮提取物中重要的活性成分。白桦脂醇对人体无毒，具有抗菌、抗病毒、神经保护、消炎、抗过敏等药理学作用[2,3]。大量研究显示，白桦脂醇对多种类型的癌症具有抑制作用，如人乳腺癌、肺癌、胰腺癌等[4-6]。但白桦脂醇对人胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡的影响尚未见报道。本文以体外培养的人胃癌MGC-803细胞为研究对象，探讨白桦脂醇对MGC-803细胞增殖和凋亡的影响，为白桦脂醇抑癌的后续研究打下基础。

1 材料与方法

1.1材料 白桦脂醇(纯度>98%，CAS：473-98-3)购自南京春秋生物；人胃癌MGC-803细胞株购自美国ATCC公司；细胞计数试剂盒(CCK-8)(货号：YS-SO-000869)购自日本同仁研究所；DMEM高糖培养基(货号：11965-092)和胎牛血清(货号：12662-029)购自美国Gibco公司；胰酶和青霉素-链霉素双抗购自美国Hyclone公司；抗体Ki67(货号：ab16667)、增殖细胞核抗原(proliferating，PCNA)(货号：ab18197)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinae，PI3K)(货号：32089)、p-AKT(货号：ab38449)、Bax(货号：ab32503)、Cleaved caspase-9(货号：ab2324)、Cleaved caspase-3(货号：ab13847)、Bcl-2(货号：ab32124)、p65(货号：ab16502)、mTOR(货号：32028)、Annexin V-PI凋亡检测试剂盒(货号：abs50001A)购自北京赛宝克公司；磷酸化蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)(货号：ab8805)、GAPDH抗体(货号：ab8245)购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人胃癌细胞MGC-803接种于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基，培养条件为37℃、5% CO2的饱和湿度培养箱。单层细胞覆盖率达80%左右时传代，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2药物毒性实验 将细胞分为：对照组、白桦脂醇低剂量组(10 μmol/L)、白桦脂醇中剂量组(20 μmol/L)和白桦脂醇高剂量组(50 μmol/L)，取对数生长期的MGC-803细胞，调整细胞密度至1×105个/ml接种于96孔板(100 μl/孔)。37℃、5%CO2培养4 h后，向对应孔中补充10 μl不同浓度的白桦脂醇，每组设置3个复孔，设置空白对照组(不加细胞悬液和药物)，继续培养24 h。向细胞中添加10 μl CCK-8溶液，继续培养2 h，酶标仪检测其490 nm处吸光值。细胞存活率=(OD药物-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100%。

1.2.3细胞计数试剂盒检测细胞增殖 细胞分组同1.2.2，取对数生长期的MGC-803细胞，调整细胞密度至5×104个/ml接种于96孔板(100 μl/孔)，37℃、5%CO2培养4 h后，向对应的孔中补充10 μl不同浓度的白桦脂醇，每组设置3个复孔，设置空白对照组(不加细胞悬液和药物)，继续培养24、48、72、96 h。向细胞中添加10 μl CCK-8溶液，继续培养2 h，酶标仪检测450 nm处吸光值。

1.2.4Western blot检测蛋白表达 MGC-803细胞培养于6孔板，当覆盖率达90%左右时，换含不同浓度白桦脂醇的培养基继续培养48 h，收集细胞，PBS清洗2次，加含蛋白酶抑制剂的裂解液，置于冰上30 min使细胞充分裂解。4℃下15 000 r/min离心20 min，取上清，BCA法测蛋白浓度。加蛋白上样缓冲液，沸水浴10 min后，每孔上样30 μg蛋白，12% SDS-PAGE分离样品。转移至PVDF膜，5%BSA室温下封闭1 h；转入稀释后的一抗Ki67(1∶2 000)、PCNA(1∶2 000)、PI3K(1∶2 000)、p-AKT(1∶ 2 000)、Bax(1∶2 000)、Cleaved caspase-3(1∶2 000)、Cleaved caspase-3(1∶2 000)，4℃摇床孵育过夜，TBST洗涤10 min×3次；加二抗室温下孵育1 h，TBST洗涤10 min×3次；加ECL显影液，成像系统中拍照。Image J软件分析各蛋白条带灰度值。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期的MGC-803细胞，于不同浓度白桦脂醇的培养基中培养24 h，1 500 r/min离心5 min收集细胞，用预冷的PBS清洗2次，加入200 μl Binding buffer重悬细胞，加入10 μl Annexin V于4℃避光条件下孵育30 min，加10 μl PI室温避光孵育5 min后，上流式细胞仪检测。采用Cellquest软件进行分析，Anv+PI-为早期凋亡细胞，Anv+PI+为晚期凋亡细胞。

1.3统计学分析 所有实验数据均采用统计学软件SPSS18.0分析。两组间比较使用t检验，多组间比较使用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同浓度白桦脂醇对MGC-803细胞存活的影响 当白桦脂醇的浓度低于50 μmol/L时，对MGC-803细胞活性无显著影响；当白桦脂醇的浓度大于50 μmol/L时，MGC-803细胞活性降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

图1 白桦脂醇分子式及不同浓度白桦脂醇对MGC-803细胞活性的影响

2.2白桦脂醇对MGC-803细胞增殖的影响 实验结果如图2所示，不同浓度白桦脂醇处理人胃癌MGC-803细胞0～4 d后，细胞增殖倍数呈不同程度的降低，其作用效果具有白桦脂醇剂量性和时间依赖性。在第4天时，白桦脂醇各组细胞增殖倍数低于MGC-803组，差异有统计学意义(P<0.01)，表明白桦脂醇能够抑制人胃癌MGC-803细胞增殖。

图2 CCK-8检测白桦脂醇对MGC-803细胞增殖的影响

2.3白桦脂醇对MGC-803细胞中Ki67和PCNA表达的影响 Western blot结果如图3所示，MGC-803细胞经不同浓度的白桦脂醇处理48 h后，白桦脂醇低剂量组细胞中Ki67表达水平无明显变化，PCNA表达水平降低(P<0.01)；白桦脂醇中、高剂量组Ki67和PCNA表达水平降低(P<0.01)，且降低作用呈白桦脂醇剂量依赖性，表明白桦脂醇能抑制人胃癌MGC-803细胞增殖标记蛋白Ki67和PCNA表达。

图3 Western blot检测白桦脂醇对增殖相关蛋白表达的影响

2.4白桦脂醇对MGC-803细胞凋亡的影响 流式细胞术结果显示，不同浓度白桦脂醇处理MGC-803细胞后，细胞凋亡比率显著增加(P<0.01),且其作用具有白桦脂醇剂量依赖性，见图4。结果表明白桦脂醇诱导MGC-803细胞凋亡。

图4 流式细胞术检测白桦脂醇对MGC-803细胞凋亡的影响

2.5白桦脂醇对MGC-803细胞中凋亡相关蛋白表达的影响 不同浓度白桦脂醇处理MGC-803细胞后，细胞中Bcl-2的表达水平降低，而Bax、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表达水平显著增加，差异均有统计学意义(P<0.01)，且其变化具有白桦脂醇剂量依赖性，见图5。

图5 Western blot检测白桦脂醇对MGC-803细胞中凋亡相关蛋白表达的影响

2.6白桦脂醇对PI3K/AKT通路相关蛋白表达水平的影响 不同浓度白桦脂醇处理胃癌细胞后，细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的比率降低，NF-κB p65和mTOR表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。上述变化具有白桦脂醇剂量依赖性，见图6。

图6 Western blot检测PI3K/AKT通路相关蛋白的表达水平

3 讨论

白桦脂醇是常见的三萜类化合物，可从白桦等植物中获取。研究显示，白桦脂醇及其衍生物可作为潜在的肿瘤治疗药物，对多种类型的肿瘤细胞具有抑制作用，如白桦脂醇能诱导多药耐药性的人肾癌细胞凋亡[7-9]。本文在此基础上研究白桦脂醇对人胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡的影响。采用药物毒性实验检测不同浓度白桦脂醇对MGC-803细胞活性影响，根据实验结果选择浓度为10、20、50 μmol/L的白桦脂醇用于后续实验。

无限增殖是恶性肿瘤细胞的重要特征之一。Li等[10]实验发现白桦脂醇通过激活AMPK信号通路，抑制肺癌细胞增殖。Orchel等[11]研究显示白桦脂醇及其衍生物能抑制黑色素瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡。本研究结果显示，不同浓度白桦脂醇作用于人胃癌MGC-803细胞后，细胞增殖倍数显著降低，Ki67和PCNA表达水平显著降低。Ki67和PCNA表达水平与细胞增殖密切相关，是检测肿瘤细胞增殖能力的可靠指标，提示白桦脂醇抑制人胃癌MGC-803细胞增殖。

在正常生理条件下，细胞增殖和细胞凋亡共同影响细胞数目，维持机体稳态。肿瘤细胞周期失常会导致肿瘤细胞快速增殖，且肿瘤细胞凋亡受到抑制，两者共同造成肿瘤细胞无限增殖。Shtilman等[12]用白桦脂醇与金属纳米颗粒联合处理正常细胞和黑色素瘤细胞，白桦脂醇对黑色素瘤的细胞毒性和细胞凋亡诱导作用呈剂量依赖性。本文研究显示，不同浓度白桦脂醇处理MGC-803细胞后，细胞凋亡比率显著增加，且其变化呈剂量依赖性。细胞凋亡通常由激活半胱氨酸蛋白酶caspase而诱发。Zhou等[13]研究发现，白桦脂醇能促进结直肠癌中NOXA蛋白表达，促进细胞色素C释放，上调caspase-9和caspase-3表达，诱导结直肠癌细胞凋亡。本研究结果与之类似，白桦脂醇处理人胃癌MGC-803细胞后，细胞中Bax、Cleaved caspase-9和Cleaved caspase-3表达水平显著升高。当细胞色素C与Apaf-1和前体caspase-9结合，使细胞中活性氧含量显著增加，线粒体膜电位降低，从而酶切caspase-9前体。活化的caspase-9又可通过酶切caspase-3前体使其活化。活化的caspase-3是细胞凋亡的关键执行者，能降解DNA复制相关蛋白、凋亡抑制蛋白及细胞骨架蛋白等，促使细胞凋亡不可逆地进行。Mihoub等[14]指出，白桦脂醇通过干扰线粒体呼吸链影响肺癌细胞生长和凋亡。白桦脂醇诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡。

PIK3/AKT通路参与细胞增殖、分化、凋亡及葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。研究发现PI3K/AKT通路活性的增加与多种癌症密切相关[15]。本研究结果显示，不同浓度白桦脂醇作用于MGC-803细胞后，细胞中PI3K和p-AKT表达水平显著降低。PI3K被激活后，通过一系列反应磷酸化激活AKT，AKT能促进凋亡抑制蛋白Bcl-2表达。Bax蛋白与Bcl-2结合形成复合体，能促进Bcl-2降解，解除Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用。Bcl-2及Bax的表达调控细胞色素C的释放，进而影响细胞凋亡[16,17]。Jing等[18]研究发现，白藜芦醇通过PTEN调控PI3K/AKT信号通路，诱导MGC-803细胞周期阻滞。Tao等[19]的实验也证实，抑制PI3K/AKT通路后，MGC-803细胞增殖受到抑制，而细胞凋亡增加。本研究表明，白桦脂醇抑制MGC-803细胞增殖，诱导细胞凋亡的作用机制可能与PI3K/AKT通路的抑制相关。

综上，不同浓度白桦脂醇处理人胃癌MGC-803细胞后，细胞增殖倍数显著降低，Ki67和PCNA表达水平显著降低，发生凋亡的细胞比率显著增加，Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表达水平显著升高，提示白桦脂醇诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡，抑制细胞增殖。但白桦脂醇对人胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡产生影响的分子机制，以及动物实验中能否产生相同的作用仍需进一步研究。