固相萃取-高效液相色谱法测定纺织品中的有害抗菌剂

徐韵扬，秦 鑫，顾 虎，胡 喆，王敏超，吴 怡

(杭州市质量技术监督检测院，浙江 杭州 310019)

纺织品所用抗菌剂主要分为有机抗菌剂、无机抗菌剂和天然抗菌剂3大类。有机抗菌剂应用时间最久，是目前织物用抗菌剂的主要产品[1]，具有见效快、杀菌能力强的优点，但存在毒性大，耐热性差，易迁移且会产生微生物耐药性等缺点[2-3]。部分有机抗菌剂已被证实具有危害性，其中2—(4—噻唑)—苯并咪唑、α—溴肉桂醛[4]、三氯卡班、4—氯—3—甲基苯酚这4种有机抗菌剂不仅会破坏人体皮肤黏膜的微生态平衡，还具有致畸性，甚至诱发癌变等危害[5]。建立纺织品中有毒有害抗菌剂的有效检测方法可以加强抗菌纺织品风险预警。

目前，抗菌剂检测研究的对象主要为医药[6-7]、化妆品[8-9]、食品及食品包装材料和环境样品[10]等。以纺织品为研究对象的研究较少，且已有文献主要是讨论纺织品中的三氯生的检测[11]。本文以α—溴肉桂醛、三氯卡班、2—(4—噻唑)—苯并咪唑、4—氯—3—甲基苯酚这4种有机抗菌剂为目标物，研究了固相萃取前处理净化技术，优化高效液相色谱分离条件，建立了纺织品中4种有毒有害抗菌剂快速检测方法，实现准确定性和定量分析纺织品中有毒有害抗菌剂。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪，配二极管阵列DAD检测器(安捷伦科技有限公司)；KQ-250TDE型高频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国密理博有限公司)。

试剂：抗菌剂，三氯卡班、α—溴肉桂醛、2—(4—噻唑)—苯并咪唑、4—氯—3—甲基苯酚；甲醇、乙腈(色谱纯，美国天地有限公司)；超纯水(18.2 mΩ·cm)。

测试样品：绿色纯棉抗菌防臭袜、白色纯棉抗菌袜、灰色纯棉抗菌T恤、白色纯棉抗菌针织棉布、印花丝绸围巾，均为市售样品。

1.2 配制标准溶液

分别称取2—(4—噻唑)—苯并咪唑(a)、4—氯—3—甲基苯酚(b)、α—溴肉桂醛(c)、三氯卡班(d) 4种抗菌剂标准品 25 mg，以乙腈为溶剂，定容至25 mL，配制成质量浓度为1 000 mg/L的单标储备液，置于4 ℃保存。混合标准工作液的配置方法：移取一定体积的单标储备液，用乙腈稀释成0.1、0.5、2.0、10.0、50.0 mg/L。

1.3 试验阳性样品的制备

按照抗菌剂100 mg/kg，轧余率100%左右，30 ℃堆置24 h的后整理工艺对市售普通棉织物用混合标准溶液浸泡，然后在室温条件下自然风干，后整理加工成试验用阳性样品，供试验条件优化使用。

1.4 样品前处理

取1.1中市售样品和1.3所制备的样品(下文简称试样)，将其剪碎至5 mm×5 mm，混匀。称取1.0 g(精确至0.001 g)试样于50 mL玻璃具塞反应瓶中，准确加入25 mL体积比为甲醇/四氢呋喃75/25的萃取液，超声提取30 min。将提取液抽滤，取1.0 mL滤液加至固相萃取小柱，用10 mL甲醇淋洗，弃去流出液，再用5 mL体积比为乙酸乙酯/乙腈4/1溶液洗脱，接收全部洗脱液。洗脱液氮吹至干，用甲醇定容至1.0 mL，过0.45 μm聚四氟乙烯PTFE滤膜，待高效液相色谱法HPLC分析。

1.5 色谱条件

反相色谱柱：安捷伦Eclipse XDB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5μm)；流动相：乙腈与水体积比为30∶70；等梯度分析12 min，流速为1.0 mL/L；柱温为30 ℃；检测波长为230、265、300 nm；进样量为10 μL。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的确定

通过高效液相色谱(HPLC)对4种有毒有害抗菌剂单标储备液的分析，获得各目标物在吸收波长200～400 nm范围内的液相光谱图(见图1)。为实现目标物的定性和定量分析，确定检测波长为230、265、300 nm。

图1 4种有毒有害抗菌剂的液相光谱图

2.2 色谱分离条件的优化

本文所研究的4种抗菌剂既不属于离子化合物，也无异构体及强亲水或强疏水基团，因此优先选用适用性及分离效果均较好的反相色谱(RPC)作为分离模式研究。试验对比了2根不同的Eclipse XDB-C18反相色谱柱，柱1：SB-Phenyl苯基液相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；柱2：Eclipse XDB-C18液相色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。不同色谱柱对4种有毒有害抗菌剂的分离色谱图的比较见图2。在以10 mmol/L乙酸铵-乙腈为流动相时，柱1存在较严重的拖尾现象，柱2能较好地实现目标物的分离，且分离度及选择性佳，故试验选用色谱柱2进行试验。

图2 不同色谱柱对4种有毒有害抗菌剂的分离色谱图的比较

乙腈-水流动相可用于低波长(185～210 nm)紫外线检测，具有黏度低、塔板数高、柱压低等优点。因此试验在Eclipse XDB-C18液相色谱柱(150 mm×4.6 mm，5μm)基础上，流动相优先选用乙腈-水作进一步研究。反相色谱(RPC)中用来改变样品选择性的参数主要有流动相组成、柱类型和柱温，其中流动相组成的改变是最为有效且方便的[12]。试验通过改变乙腈体积比例来比较不同溶剂强度对目标物选择性的影响。结果显示，当乙腈体积分数为70%时，4种目标物可在10 min内得到最佳的分离度及保留值，4种有毒有害抗菌剂混合标准溶液的液相色谱图见图3。

图3 4种有毒有害抗菌剂混合标准溶液的液相色谱图

2.3 前处理条件的优化

纺织品抗菌剂一般在后整理阶段添加到产品中，为实现纺织品中抗菌剂的检测，首先需要把抗菌剂从纺织品中提取出来。本文研究采用超声萃取法来提取样品中的抗菌剂，优化萃取剂种类、萃取温度、萃取时间3个条件是提高超声萃取效率的关键。首先考察甲醇/四氢呋喃8/2、甲醇/四氢呋喃5/5、甲醇/四氢呋喃3/7作为萃取剂对目标物的萃取效率。称取1.0 g(精确至0.001 g)自制的阳性样品，分别加入上述4种萃取剂，超声萃取30 min，观察4种待测抗菌剂的萃取效率。不同萃取剂对4种抗菌剂的萃取率见图4。可以看出，甲醇-四氢呋喃二元体系萃取效率优于单一的甲醇萃取剂；二元萃取剂体系中四氢呋喃比例的提升，萃取效率逐渐增大，故试验选择甲醇/四氢呋喃体积比3/7作为萃取剂。

图4 不同萃取剂对4种有毒有害抗菌剂的萃取效率

为取得超声萃取的最大萃取效率，试验还分别对比了萃取10、20、30、40、60 min以及不同萃取温度的萃取效率。结果显示，随着萃取时间的提高，萃取效率不断提升，当萃取时间超过30 min，萃取效率趋向平稳；而萃取温度的变化对目标物萃取效率几乎没有影响。综合考虑试验室温度条件的影响，选择萃取时间30 min，萃取温度30 ℃作为下一步研究的条件。

在进行样品分析时，发现样品颜色对目标物的检测有较大干扰，主要是由于颜色多样的样品通常加入不同成分的染料以及各种助剂，这些染料和助剂会和目标物一同被萃取下来，造成分析干扰。为准确高效地分析目标物，试验采用固相萃取法对萃取样液进行净化处理。固相萃取法可以将目标物萃取得更彻底，降低杂质对目标物的干扰。试验对150 mg/mL的混合型弱阴离子Oasis WAX、500 mg/mL的强阳离子(SCX)和200 mg/(6 mL)的Select HLB 3种固相萃取柱进行了萃取效果比较，3根固相萃取柱的上样量均为1.0 mL，分段收集检测流出液。结果显示，Oasis WAX固相柱在上样液中未检出目标物，在随后的5 mL甲醇洗脱液中检出4种目标物，且萃取液的净化效果不显著；HLB固相萃取柱，在上样液流出液中就能检出目标物，且杂质峰干扰严重；SCX固相萃取柱，在上样液流出液和5 mL甲醇洗脱液中未检出4种目标物，在后续的5 mL体积比为乙酸乙酯/乙腈4/1的洗脱液种检测到目标物，回收率在80%～100%，且萃取液净化除色效果明显，可明显消除杂质对目标物的干扰。因此选择SCX固相萃取柱进行萃取液的净化。

2.4 线性关系、检出限和定量限

按优化后的仪器条件，测试质量浓度为0.5、5.0、20.0、50.0、100.0 mg/L系列的混合标准溶液，以目标物的色谱峰面积为纵坐标y，相应质量浓度为横坐标x绘制标准曲线，所得各待测物拟合曲线相关系数R2均大于0.999，以3倍信噪比确定仪器检出限为0.1～0.3 mg/L，结合样品称样量和稀释倍数，以10倍信噪比确定方法定量限为2.2～3.6 mg/kg，4种有毒有害抗菌剂的分析见表1。

表1 4种有毒有害抗菌剂的分析

2.5 回收率与精密度试验

采用1.3工艺制备的阳性样品，按照本文固相萃取-高效液相色谱法的试验方法进行处理，按每个试验添加质量浓度平行试验6次计算回收率，测得平均回收率为86.5%～100.3%，相对标准偏差小于5%，4种有毒有害抗菌剂加标回收率和相对标准偏差见表2。

2.6 实际样品测定

采用本文方法对1.1中5个市售测试样品中的抗菌剂进行检测，结果仅在印花丝绸围巾中检出4—氯—3—甲基苯酚，含量为28.6 mg/kg，其余样品未检出抗菌剂。5个市售样品中抗菌剂检测结果见表3。根据测试结果可知，目前市售抗菌纺织产品中存在使用有毒有害抗菌剂情况，但是大部分抗菌产品具有相对安全性。

3 结束语

本文通过固相萃取-高效液相色谱法对纺织品中三氯卡班、α—溴肉桂醛、2—(4—噻唑)—苯并咪唑、4—氯—3—甲基苯酚4种有毒有害抗菌剂进行研究，从不同种类的萃取溶剂、萃取时间和萃取体积比例3个方面，对固相萃取前处理条件进行优化；从流动相组成和液相色谱柱种类，对液相色谱条件进行选择，实现了纺织品中三氯卡班、α—溴肉桂醛、2—(4—噻唑)—苯并咪唑、4—氯—3—甲基苯酚4种有毒有害抗菌剂的固相萃取-高效液相色谱法的定性和定量分析。固相萃取-高效液相色谱法为有效控制纺织产品中有毒有害抗菌剂提供技术支撑，为深入研究有毒有害抗菌剂的环境行为和生态效应奠定技术基础。