致羔羊腹泻大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

李 托，李陇平,2，张起艳，高 妮，薛佳敏

(1.榆林学院生命科学学院，陕西 榆林 719000 ;2.榆林学院 陕西省陕北绒山羊工程技术研究中心，陕西 榆林 719000)

以陕北白绒山羊为主的羊产业已经成为陕北地区农业发展和农牧民增收的主导产业，对区域经济发展具有不可替代的重要作用[1]。但是，羔羊和成年羊只的大面积群体性死亡一直是困扰陕北白绒山羊养殖的一个重要问题。其中，致病性大肠杆菌可以诱导山羊多种致死性疾病，病理复杂多样，导致包括以败血症和剧烈腹泻为特征的急性传染病和乳房炎，不仅危害泌乳期母羊自身健康，而且严重危害羔羊健康[2-3]。有效防治山羊大肠杆菌病是促进山羊产业健康、快速、可持续发展的关键。目前，抗生素仍然是有效防治山羊疾病的主要手段，从而造成多种抗生素的大量使用，甚至是滥用。大量使用抗生素导致耐药基因和耐药细菌特别是多重耐药菌株不断出现和快速传播[4-6]，不仅破坏动物体内正常微生态平衡，危害动物健康和生态环境[7]，而且造成药物在动物体内残留进入人们餐桌，威胁人类健康和公共食品卫生安全[8]。抗生素耐药问题已经成为影响人类健康和养殖业健康发展的重要因素[9]。

本试验通过采集患病羔羊组织样品，利用常规生物化学方法和分子生物学方法对导致羔羊腹泻的大肠杆菌进行分离鉴定，并对分离菌株的血清型、耐药性和致病性进行检测，为有效防控陕北地区绒山羊源大肠杆菌病提供科学依据。

1 材料

1.1 病料 从陕西省榆林市某规模化绒山羊养殖场采集1只病死羔羊的肝脏、肾脏、脾脏、肺脏和直肠棉拭子。

1.2 主要试剂 细菌微量生化鉴定管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；Mueller Hinton琼脂、药敏纸片，均购自英国OXOID公司；引物由上海百力格生物科技有限公司合成；大肠杆菌诊断血清，购自中国兽医药品监察所；20 g左右健康昆明系小鼠20只，购自西安交通大学医学院。

2 方法

2.1 细菌分离纯化 样品分别接种于LB和麦康凯琼脂，37 ℃倒置培养16～24 h；选择优势菌落接种伊红美蓝琼脂，观察菌落形态为紫黑色并带有金属光泽；挑取伊红美蓝琼脂上的典型菌落培养过夜，与等体积50%的甘油混匀,-80 ℃保存备用。

2.2 细菌革兰染色 草酸铵结晶紫初染1～2 min；碘液媒染1～3 min；95%酒精脱色30 s；沙黄溶液复染1 min；最后，油镜观察菌落染色及形态。

2.3 细菌的生化试验 纯培养的菌液接种至不同细菌微量生化鉴定管(甲基红、V-P、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、乳糖、蔗糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、吲哚、山梨醇、枸椽酸盐、尿素酶、硫化氢等)进行细菌初步鉴定。

2.4 细菌的血清型鉴定 采用玻片法鉴定分离菌株的O血清型类别。

2.5 细菌的分子生物学鉴定

2.5.1 细菌基因组提取(煮沸法) 37 ℃、220 r/min过夜培养菌液取1 mL，12 000 r/min离心10 min；弃上清，加入1 mL无菌水，清洗1次；100 ℃煮沸10 min；室温放置10 min；冷却至室温后12 000 r/min离心10 min；收集上清液，即得到DNA；取5 μL DNA进行电泳检测，其余-20 ℃保存备用。

2.5.2 细菌16S rDNA基因扩增 以煮沸法提取的DNA为模版扩增分离株的16S rDNA基因，使用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增，片段大小预计1 492 bp，50 μL扩增体系：2×Easy PCR SuperMix(+dye)25 μL，上下游引物各1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 22 μL。反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，68 ℃→58 ℃(每个循环降低1 ℃)进行11个循环，72 ℃ 90 s，25个循环;72 ℃延伸10 min。

PCR扩增产物回收纯化后连接pEasy®-T5 Zero Cloning载体，转化Trans1-T1感受态细胞，经PCR(M13F和M13R)鉴定阳性的克隆接种2 mL LB/Amp+培养基，200 r/min、37 ℃培养6 h后，送上海百力格生物科技有限公司测序。序列BLAST同源性比对，并构建系统进化树。

2.5.3 药敏试验 选择红霉素、克林霉素、头孢噻吩、恩诺沙星、链霉素、亚胺培南、氨苄西林、四环素、庆大霉素、复方新诺明、氟苯尼考、硫酸黏菌素、头孢他定、氯霉素共14种抗菌药物进行药敏试验。100 μL菌液和900 μL生理盐水混匀，调整菌液浓度1.5×108CFU/mL(相当于0.5麦氏标准)。无菌棉签蘸取菌悬液均匀涂抹M-H琼脂。自然干燥后用灭菌镊子夹取药敏纸片贴于培养基表面，边缘距边缘15 cm，37 ℃倒置培养18～24 h，测量抑菌圈直径。敏感性判定标准参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)颁布的《抗微生物药物敏感性试验执行标准》[10-11]。

2.6 致病性试验 20只小鼠分为4组，每组5只。3个试验组进行攻毒，每组按0.5 mL/只的菌液(1×108CFU/mL)腹腔注射，对照组小鼠注射0.5 mL/只LB培养基。观察小鼠发病及死亡情况，剖检，采集小鼠肝脏、肺脏等组织进行细菌分离。

3 结果

3.1 细菌分离鉴定

3.1.1 细菌分离及形态学鉴定 采集1只病死羔羊的肝脏、肾脏、脾脏、肺脏和直肠棉拭子样品，严格无菌条件下接种LB琼脂和伊红美蓝琼脂培养后，共分离到3株大肠杆菌，命名为EG-1，EG-2，EG-3。分离株在LB琼脂上的菌落形态为圆形、凸起、光滑、灰白色、半透明，直径为2～3 mm；麦康凯琼脂平板上菌落形态为边缘光滑整齐、湿润的扁圆粉红色；伊红美蓝琼脂平板上的菌落形态为圆形、表面光滑、稍凸起、边缘整齐、紫黑色并带金属光泽。分离株革兰染色为红色(革兰阴性菌)、两端钝圆、杆状。

3.1.2 细菌生化鉴定 分离株均能发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖和甘露糖，尿素酶、阿拉伯糖、鼠李糖、麦芽糖、山梨醇、赖氨酸脱羧酶，产酸不产气；吲哚试验、甲基红试验结果均为阳性，V-P 试验、硫化氢试验及枸橼酸盐试验结果均为阴性，根据《伯杰细菌鉴定手册》的判断标准，分离株与大肠杆菌生化特性相一致。

3.1.3 细菌血清型鉴定 血清学试验表明，分离的3株大肠杆菌属于2个不同的血清型，EG-1为O119型，EG-2和EG-3为O24型。

3.2 分子生物学鉴定 煮沸法提取基因组DNA后通用引物扩增分离株16S rDNA基因，PCR扩增条带与目的片段大小一致(图1)。测序结果表明：分离株与NCBI数据库中大肠杆菌菌株同源性在99.7%以上，与大肠杆菌44A(登录号：KP789331.1)、NCTC122(登录号：LT906474.1)和ECOL-18-VL-LA-PA-Ryan-0026(登录号：CP041392.1)在同一个遗传进化分支上，与粪肠球菌NCTC8732(登录号：LR594051.1)亲缘关系较远(图2)。

3.3 药敏试验 分离株均对红霉素、克林霉素、恩诺沙星、链霉素、氨苄西林、四环素、庆大霉素、黏菌素产生耐药；所有菌株对亚胺培南、头孢他定和氯霉素敏感；除此之外，EG-1对头孢噻吩、复方新诺明和氟苯尼考均产生耐药，EG-2对复方新诺明和氟苯尼考产生耐药，EG-3对这3种抗生素菌均敏感(表1)。

表1 细菌耐药性结果

3.4 致病性试验 试验组小鼠分别在8～16 h内发病死亡，剖检后从小鼠体内分离到病原菌，对照组5只小鼠健康存活。结果表明，该分离菌株具有一定的致病性。

4 讨论

大肠杆菌可导致山羊严重的疾病，致死性高，对羔羊危害严重。从陕西省某规模化绒山羊养殖场羔羊腹泻病料中分离鉴定到3株革兰阴性杆菌，命名为EG-1、EG-2和EG-3，从形态学观察、培养特性及生化试验鉴定结果等方面和《伯杰细菌鉴定手册》的报道一致，证实分离株为大肠杆菌。将分离株(1×108CFU/mL)腹腔注射小鼠后，小鼠在8～16 h内发病死亡，剖检后从死亡的小鼠体内分离到病原菌。小鼠感染试验证实了该分离株具有一定的致病性，且是引起该羊场羔羊腹泻的主要病原菌。2018年,姜德相等[12]于白城地区采集的127份腹泻羔羊粪便样品中，分离鉴定到56株致病性大肠杆菌，也都具有较强的致病性。本试验结果与武庭斌[13]、陈颢等[14]的报道一致。说明致病性大肠杆菌是引起羔羊腹泻的主要病原菌，应该加强防范并注意防控措施，同时要做好病原菌的诊断，及时作出科学合理的应对措施。

大肠杆菌抗原结构复杂，血清型较多，不同地区的大肠杆菌分离株血清型不一样，并且具有地区性特征，加之不同血清型大肠杆菌之间缺乏有效的交叉免疫保护，从而给大肠杆菌病的有效防治增加了难度[15]。本试验中3株致病性大肠的血清型分别为O119型(EG-1)、O24型(EG-2、EG-3)。本试验结果与谭诗文等[16]2000年报道的贵州地区和姜德相等[5]2018年报道的白城地区导致羔羊腹泻的致病性大肠杆菌主要血清型一致。然而，马利青等[17]报道的青海地区引起羔羊腹泻的大肠杆菌以O8、O26、O55、O78、O86、O101、O111型和 O126型为优势血清型。因此，不同地区山羊源致病性大肠杆菌血清型存在差异，故搞清楚本地区致病性大肠杆菌的优势血清型对于有效防制大肠杆菌引起的山羊疾病有着重要的作用。药敏试验结果说明，引起该地区羔羊腹泻的菌株具有较强的耐药性，应定期对规模化绒山羊养殖场病原进行检测及药敏试验，选择敏感药物交替使用，减少细菌耐药和药物残留，促进绒山羊高效健康养殖。除此之外，还应加强饲养管理，搞好环境卫生工作，尝试使用中草药、营养添加剂、噬菌体生物制剂、益生菌、抗菌肽等新型生物制品，提高绒山羊免疫力，有效防控疾病的发生和传播。