基于GEO数据库对慢性乙型肝炎中关键miRNAs筛选及其生物信息学分析

王庆辉，钱惠忠，张媛媛，夏卫，刘晓，郝庆钦

无锡市中心血站，江苏无锡214000

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是重大的全球性公共卫生问题，具有较高的发病率和病死率[1,2]。由于HBV感染的发生发展过程较复杂，慢性乙型肝炎(CHB)的发病机制仍未阐明。miRNAs是一类长度为21～25 nt的非编码RNA，通过与mRNA靶向结合调控相应蛋白表达水平，在多种疾病的发生发展中起到重要调节作用[3]。近年研究表明，在HBV感染的过程中存在特征性的miRNAs表达谱并发挥重要作用，与病毒的复制和转录、疾病进展和预后密切相关[4]。2020年1～3月，我们借助生物信息学技术深入挖掘CHB患者肝组织miRNAs表达谱，初步探索其在CHB发生、发展中的潜在作用机制，为CHB发病机制的实验研究和将来治疗靶点的选择提供数据和基础。

1 资料与方法

1.1 数据来源 从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)检索下载CHB患者miRNAs表达芯片数据，纳入标准：①研究对象包含CHB患者和正常对照；②样品为人肝脏组织；③研究类型为“Non-coding RNA profiling by array”。最终筛选出GSE110217芯片数据，该芯片采用GPL15018平台(Agilent-031181 Unrestricted_Human_miRNA_V16.0_ Microarray030840)，包含42个肝组织样本，其中8个接受治疗前的CHB患者和4个正常肝脏组织样本数据被提取进行进一步研究。

1.2 差异表达的miRNAs的筛选 在R软件环境下应用limma软件包对矩阵数据进行校正标准化和log2转换，当多个探针对应到一个miRNA时，取多个探针的均值作为其相应的表达值。最后以差异倍数(FC)≥2、错误发现率(FDR)<0.05作为标准，筛选差异表达的miRNAs。

1.3 miRNAs靶基因预测 从miRDB(http://mirdb.org/)、miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)和TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)下载比对数据库。借助Perl脚本，提取同时在这3种数据库比对成功的基因为miRNAs靶基因。

1.4 靶基因生物学功能和信号通路富集分析 采用DAVID在线数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对目的基因进行生物学功能(GO)分析；同时利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库对基因进行生物通路富集分析。以P<0.01为标准，筛选靶基因所涉及的有意义的生物学功能和通路。

1.5 靶基因蛋白相互作用(PPI)网络分析 String(https://string-db.org/)是利用已知或预测的蛋白质相互作用数据组成的数据库，包括直接和间接的蛋白质间相互作用。通过此数据库对靶基因进行相互作用网络分析，并借助Cytoscape软件进行可视化，数据设置条件为评分>0.9。进一步利用Cytohubba插件对靶基因自由度(Degree)进行计算，筛选关键基因。

1.6 miRNAs的转录因子预测和富集分析 通过Transmir 2.0(http://www.cuilab.cn/transmir)数据库在线预测和富集分析，以P<0.05为标准进行筛选。迄今为止，Transmir 2.0数据库包含由1 394篇文献验证的3 730对转录因子-miRNAs和1 785 998对ChIP-seq来源的转录因子-miRNAs，通过该数据库可以识别转录因子和miRNAs之间的关联。

1.7 转录因子-miRNAs-靶基因调控网络分析 以富集在乙型肝炎(hsa05161)通路上的靶基因为基础，筛选相应的差异表达的miRNAs，并对这些miRNAs进行转录因子的预测和富集分析，最终构建富集的转录因子-miRNAs-靶基因的调控关系网络并可视化。

2 结果

2.1 差异表达的miRNAs和mRNA筛选分析结果 通过R语言分析，GSE110217中有33个miRNAs差异性表达，其中10个表达上调，23个表达下调，见表1。

表1 GSE110217中33个miRNAs在CHB差异表达特征

2.2 miRNAs靶基因预测及生物功能富集分析结果 33个差异表达的miRNAs的靶基因经miRDB、miRTarBase、TargetScan数据库进行预测，取交集共得到747个靶基因。进一步应用生物信息学手段对上述靶基因进行功能注释富集分析，结果见表2。GO分析显示，靶基因主要涉及转录调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的调控、细胞分裂、凋亡过程负调控、细胞黏附等生物学过程。KEGG分析显示，靶基因主要富集在乙型肝炎、人类嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型感染以及PI3K/AKT、FoxO、Hippo信号通路等。其中有21个靶基因富集在乙型肝炎通路中，分别为PRKCA、YWHAZ、MAP2K4、SMAD4、YWHAB、TIRAP、ELK1、FASLG、BIRC5、CDK6、DDX58、CCNE2、NRAS、CCND1、DDX3X、YWHAQ、PCNA、JAK1、MAPK8、IKBKB和NFATC3。

表2 差异表达的miRNAs的靶基因生物学功能和通路富集分析前10位情况

2.3 miRNAs靶基因PPI分析结果 在构建的PPI网络中，依据蛋白间相互作用程度(Degree≥19)，从中共鉴定出16个核心靶基因，依次为CDC5L、GTF2F1、UBE2D1、NRAS、ESR1、CBFB、SOCS3、NR3C1、MAPK8、PRKCA、RNF111、SMAD4、FBXL、FN1、YWHAB和SMAD3。主要富集在RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的调控、TGF-β2生成的调节、SMAD蛋白复合体的形成及蛋白泛素化等生物学过程，以及乙型肝炎通路和PI3K-AKT、FoxO、Hippo等信号通路。其中有5个核心靶基因涉及在乙型肝炎通路中，分别为MAPK8、SMAD4、YWHAB、NRAS和PRKCA。

2.4 转录因子-miRNAs-靶基因调控网络的构建结果 如图1，共有21个靶基因涉及乙型肝炎通路，其中PRKCA、SMAD4、YWHAB、NRAS、MAPK8也是PPI网络中核心靶基因。涉及的miRNAs分别为hsa-miR-218、-363、-30b、-513a-5p、-3652、-1、-214*、-145、-542-3p、-502-3p，其中hsa-miR-218可调控此通路中的6个基因。另外，这10个miRNAs的富集转录因子共25个，其中USF1核心作用明显。

注：菱形为miRNAs的富集的转录因子，长方形为miRNAs,椭圆形为靶基因

3 讨论

CHB是慢性HBV感染的一个阶段，可进展为肝硬化、肝衰竭、肝细胞癌等严重肝脏疾病[5]。目前CHB的治疗药物主要包括聚乙二醇干扰素和核苷酸类似物，然而由于患者体内病毒cccDNA的持续存在，以及机体对HBV持续强有力的免疫功能的缺乏，疗效仍不理想[6]。因此，为进一步提高疗效，改善患者预后，亟待阐明CHB的发病机制。近年研究表明，miRNAs在HBV感染相关疾病中的异常表达与疾病的发生发展密切相关[7，8]。一方面，机体miRNAs可以通过直接与HBV转录本结合或间接靶向于HBV生命周期相关的细胞因子，从而调控HBV转录和复制[9]；另一方面，HBV感染可干扰宿主miRNAs表达，导致相应靶基因的功能失调[7，10]；此外，HBV也可编码miRNAs(HBV-miR-3)，调控自身的生命活动[11]。然而miRNAs在CHB发生发展中的潜在作用机制仍不清楚。

本研究利用GEO数据库中的CHB的miRNAs芯片表达数据，筛选出33个差异表达的miRNAs，并通过预测获得747个靶基因。生物过程分析提示，差异表达的miRNAs主要参与RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的调控，细胞分裂、凋亡过程负调控及细胞黏附等生物过程；通路分析显示，主要涉及乙型肝炎通路和PI3K/AKT、FoxO、Hippo信号通路等。随后通过PPI网络分析筛出16个核心靶基因，功能富集分析显示，同样涉及乙型肝炎通路和PI3K/AKT、FoxO和Hippo等信号通路。这些结果提示，miRNAs可能通过乙型肝炎通路在CHB发病过程中发挥重要作用。进一步分析发现，本研究涉及的此通路中21个靶基因中，5个为PPI网络中的核心靶基因，分别为MAPK8、SMAD4、YWHAB、NRAS和PRKCA。因此，我们推测这5个基因在CHB的发生发展中可能发挥重要作用。

MAPK信号通路是在机体对外来微生物固有免疫应答中一重要通路，其中MAPK8不仅可通过促进转录因子的磷酸化上调促炎症的细胞因子和趋化因子表达，同时也可以调控辅助性T细胞(Th)向Th1分化[12]。Cao等[13]研究发现，MAPK8的多态性可影响着Th1介导的抗HBV细胞免疫应答，并导致抗HBsAg抗体的产生。SMAD4是TGF-β信号通路中一个重要因子，其包含一个核定位信号，能充当细胞核和细胞质之间交流载体。据报道，miR-34a-5p可以靶向TGF-β信号通路中SMAD4介导肝纤维化[14]。另外，Smad4也是一个被HBx调控的转录因子，HBx通过Smad4可上调NUPR1表达，后者可抑制肝细胞的凋亡和诱导血管生成拟态，促进肿瘤生成。然而，目前尚无PRKCA、YWHAB和NRAS在HBV感染性疾病中的相关报道。

最后，考虑到乙型肝炎通路在CHB发生发展过程中的重要作用，我们选取此通路中本研究涉及的21个靶基因为基准，构建转录因子-miRNAs-靶基因调控关系网络，进而探讨CHB中关键miRNAs及其潜在的分子作用机制。结果显示，有10个miRNAs，即hsa-miR-218、-363、-30b、-513a-5p、-3652、-1、-214*、-145、-542-3p、-502-3p可能通过调控乙型肝炎通路中的基因参与CHB的发生发展，其中以hsa-miR-218的作用最具有多样性。在上述miRNAs中，miR-1、-218、-30b、-214-3p、-145已被研究报道可能与HBV感染相关性疾病的发生发展相关。Zhang等[15]报道，miR-1可促进HBV的复制、子代病毒分泌和抗原表达，其机制主要是通过增强FXRA表达、增强HBV核心启动子转录活性，从而增强HBV复制和转录。Han等[16]报道，miR-218启动子rs11134527不仅可增加HCC患病的风险，而且与男性体内HBV preS缺失密切相关；其与HBV基因T1674C/G及preS1起始密码突变相互作用可影响肝细胞癌变的进程。Chen等[17]报道，IL-6R在CHB肝硬化患者中表达上调，而miR-30b表达下调，miR-30b可直接靶向调节IL-6R，参与慢性HBV感染后肝纤维化进程。Chen等[18]利用芯片检测技术在CHB伴纤维化患者的肝组织中共鉴定出105个差异表达的miRNAs，其中hsa-miR-214-3p能够最高效地区分肝纤维化，并与肝组织脏炎症程度相关。Gao等[19]研究显示，HBV感染可通过HBx蛋白下调miR-145的表达，进而导致靶基因CUL5的表达上调，最终促进肝细胞的生长增殖。目前尚无hsa-miR-363、-513a-5p、-3652、-542-3p、-502-3p在HBV感染性疾病中的相关报道，但其在CHB中的作用同样值得研究。

本研究的不足之处在于：首先，经筛选符合条件的肝组织miRNAs表达芯片有限，并且纳入的组织样本量较少，对研究结果可能会造成一定偏倚；其次，筛选出的关键miRNAs及参与调控的通路仅是通过生物信息学方法获得，仍需后期进一步实验验证。

综上所述，本研究利用生物信息学技术筛选出在CHB患者肝组织中差异表达的miRNAs，随后通过对靶基因富集分析探讨这些miRNAs参与调控的生物过程及相关信号通路，并进一步从中筛选具有核心功能的miRNAs，构建以其为核心的调控网络，从而更好地解析CHB发病过程中关键miRNAs及其潜在的分子作用机制途径，为后期实验研究和CHB新治疗靶点的选择提供数据和理论基础。