二甲双胍对肝癌细胞凋亡及PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响

陶荔，曹莺

苏州大学附属张家港医院，江苏张家港215600

肝癌起病隐匿，大多数患者发现时已是中晚期，失去手术机会。流行病学研究显示，糖尿病与肝癌的发生发展有关，糖尿病患者发生肝癌的风险是正常人群的2～3倍，同时，合并糖尿病的肝癌患者肿瘤转移更快、预后更差[1，2]。二甲双胍是治疗2型糖尿病的一线药物，研究发现，二甲双胍能够降低2型糖尿病患者乳腺癌、肝癌、胰腺癌等的发病率[3，4]，并改善恶性肿瘤患者预后[5，6]，提示二甲双胍具有潜在的抗肿瘤作用。2017年9月～2019年12月，我们观察了二甲双胍对肝癌细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其可能的分子机制，为二甲双胍用于肝癌治疗提供理论依据。

1 材料

1.1 细胞、试剂与仪器 人肝癌SMMC-7721细胞株购自上海中科院细胞库。二甲双胍(上海碧云天生物技术有限公司)，RPMI-1640培养基(Corning公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，MTT(北京索莱宝科技有限公司)，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡检测试剂盒(美国BD公司)，凋亡相关蛋白Bax抗体(美国Cell Signaling公司)、Bcl-2抗体(Abcam公司)，PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR抗体以及内参蛋白α-Tublin抗体(美国Cell Signaling公司)。Varioskan Flash酶标仪(美国Thermo公司)，FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 细胞培养 将SMMC-7721细胞加入含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的RMPI-1640培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞密度达到80%后进行传代，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3 二甲双胍最佳作用浓度和时间的筛选 采用MTT法。取对数生长期细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，调整细胞密度为1×105/mL，按100 μL/孔接种于96孔板中，培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后，弃培养基，分别加入5、10、20、40、80 mmol/L二甲双胍分别处理24 h、48 h，每个浓度设置3个复孔，另设对照组，加入同体积的培养基。加入0.5% MTT溶液继续培养4 h，加入100 μL二甲基亚砜振荡15 min，至蓝色晶体完全溶解。用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度(A)值。细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%。根据不同浓度下的细胞存活率(表1)，计算二甲双胍作用于细胞24、48 h的IC50值分别为36.05、25.76 mmol/L。根据细胞存活率及IC50结果，综合评价药物效果与细胞毒性后，采用5、10、20 mmol/L二甲双胍处理48 h进行后续实验。

表1 不同浓度二甲双胍作用24、48 h的细胞存活率

1.4 细胞凋亡检测 采用流式细胞术。取对数生长期细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，调整细胞密度为1×105/mL，按2 mL/孔接种于6孔板中，培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后，弃培养基，将细胞分为二甲双胍组和对照组，二甲双胍组分别加入5、10、20 mmol/L二甲双胍处理48 h，对照组加入同体积的培养基。收集各组细胞，用预冷的PBS冲洗3次，离心弃上清，加入Annexin Ⅴ-FITC结合液重悬，再加入PI染色液混匀，避光孵育15 min，上流式细胞仪检测。

1.5 凋亡相关蛋白以及PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达检测 采用Western blotting法。取对数生长期细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，调整细胞密度为2.5×105/mL，按2 mL/孔接种于6孔板中，培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后，弃培养基，将细胞分为二甲双胍组和对照组，二甲双胍组分别加入5、10、20 mmol/L二甲双胍处理48 h，对照组加入同体积的培养基。收集细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液于冰上裂解20 min，离心，收集上清液，用BCA法进行蛋白定量。取40 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后将蛋白转印到PVDF膜上，用5%的脱脂牛奶室温封闭1.5 h。分别加入一抗(Bax、Bcl-2稀释倍数为1∶500，AKT、mTOR、p-AKT、p-mTOR稀释倍数为1∶1 000，α-Tublin稀释倍数为1∶5 000)4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次，加入二抗室温孵育2 h。TBST洗涤3次，使用ECL发光显影。图像采用Image J软件进行灰度分析。以目的蛋白条带灰度值与内参α-Tublin灰度值的比值表示蛋白相对表达量。以Bcl-2/Bax比值表示细胞凋亡程度，以p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表示蛋白磷酸化水平。

2 结果

2.1 各组细胞凋亡率比较 对照组及二甲双胍组5、10、20 mmol/L作用48 h后的细胞凋亡率分别为4.23%±0.49%、16.71%±1.64%、20.61%±2.48%、30.78±1.11%，二甲双胍组不同浓度作用后的细胞凋亡率均高于对照组(P<0.05或<0.01)。

2.2 各组细胞Bax、Bcl-2蛋白表达比较 与对照组比较，二甲双胍组5 mmol/L作用后Bax蛋白表达水平无统计学差异(P>0.05)，二甲双胍组10、20 mmol/L作用后Bax蛋白表达升高(P均<0.05)；二甲双胍组不同浓度作用后Bcl-2蛋白表达水平、Bcl-2/Bax均降低(P<0.05或<0.01)。见表2。

表2 各组细胞Bax、Bcl-2蛋白表达水平比较

2.3 各组细胞p-AKT、p-mTOR蛋白表达比较 与对照组相比，二甲双胍组p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平均降低(P<0.05或P<0.01)。见表3。

表3 各组细胞p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平比较

3 讨论

原发性肝癌是常见的消化道恶性肿瘤之一。据统计，全球每年约有70万以上的人死于肝癌，而中国的肝癌患者占其中一半以上。目前肝癌的治疗包括放化疗、介入化疗栓塞、射频消融、靶向和免疫药物治疗等综合治疗，但仍不能有效预防其复发和转移[7]。以索拉菲尼为代表的靶向药物在肝癌的治疗方面取得了一定的疗效，但是长期使用容易产生耐受并导致严重不良反应[8]，影响患者的生活质量以及预后。因此，寻找安全有效的药物是肝癌治疗中亟待解决的问题。

二甲双胍是双胍类口服降糖药，通过减少肝糖原异生，增加周围组织对胰岛素的敏感性，并抑制肠道组织对葡萄糖的摄取发挥降血糖作用。2型糖尿病患者发生恶性肿瘤如乳腺癌、结肠癌、肝癌、子宫内膜癌、胰腺癌等的风险高于正常人群，其原因可能与2型糖尿病中胰岛素抵抗、高胰岛素血症、糖脂代谢紊乱以及胰岛素样生长因子1水平升高有关[9]。体内外实验表明，二甲双胍能够抑制多种恶性肿瘤如乳腺癌[3]、胰腺癌[5]、子宫内膜癌[10]、肺癌[11]的生长。其抗肿瘤作用机制包括两方面：①直接作用：二甲双胍直接作用于肿瘤细胞，引起细胞周期阻滞或者细胞凋亡，最终抑制肿瘤的生长;②间接作用：二甲双胍通过改善胰岛素抵抗，调节胰岛素/胰岛素样生长因子1轴抑制肿瘤细胞的增殖，降低肿瘤发生的风险。

糖尿病是肝癌发生的高风险因素之一。Wang等[12]的Meta分析表明，糖尿病患者发生肝癌的风险显著高于正常人群；另有研究显示，服用二甲双胍的糖尿病患者肝癌发生率明显降低，并且二甲双胍能够降低肝癌相关病死率[13，14]。这提示二甲双胍对肝癌的发生发展具有抑制作用，但具体作用机制尚不明确。本研究结果显示，5、10、20 mmol/L二甲双胍作用于肝癌细胞24、48 h后，细胞存活率均低于对照组。这表明二甲双胍能够抑制肝癌细胞增殖，促进其凋亡，从而抑制肝癌的进展。

肿瘤的发生发展是一个由多种信号通路共同作用的复杂过程，而细胞凋亡途径是肿瘤形成过程中的重要环节。细胞凋亡是一种程序性死亡，是由相关基因调控的。目前研究的与肿瘤凋亡密切相关的基因有Bcl-2、Caspases家族等，其中Bcl-2家族在线粒体介导的细胞凋亡过程中起着关键作用;Bax是促凋亡蛋白，通过调节细胞线粒体膜的通透性，促进细胞色素C的释放，激活Caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。Bcl-2是抗凋亡蛋白，与Bax相反，通过阻止细胞色素C的释放从而抑制细胞凋亡[15]。在很多肿瘤细胞中，由于Bcl-2家族促凋亡蛋白减少，抗凋亡蛋白表达升高，导致细胞凋亡减少，因此调节Bcl-2和Bax等相关凋亡蛋白的表达，诱导肿瘤细胞凋亡，能够有效地抑制肿瘤的生长。另外，Bcl-2/Bax也能反映细胞凋亡程度，Bcl-2/Bax上调表明抑制细胞凋亡，Bcl-2/Bax下调表明促进细胞凋亡[16]。本研究结果显示，不同浓度二甲双胍作用于肝癌细胞后，Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax蛋白表达水平升高，Bcl-2/Bax降低，表明二甲双胍能够通过调控凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达，诱导肝癌细胞凋亡。

随着对肿瘤的研究逐步深入，多种信号通路被发现参与到肿瘤的发生发展中，其中PI3K/AKT/mTOR信号通路在肺癌、肝癌等多种肿瘤中均被激活，在肿瘤细胞增殖和凋亡过程中起重要作用[17]。PI3K是一种存在于细胞质的脂类激酶，可以催化磷酯酰肌醇D3位的磷酸化。AKT是高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K的下游蛋白之一，激活的磷酸化AKT具有促进细胞增殖、抗凋亡的作用。mTOR属于PI3K蛋白激酶类家族，也是PI3K信号通路下游分子之一。研究表明，激活的PI3K/AKT信号通路可以通过影响Bcl-2家族来抑制细胞凋亡，进而促进细胞增殖[18]。mTOR信号通路激活与肝癌的发生发展有着密切联系。在一项胰腺癌的研究中发现，二甲双胍能够抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而抑制胰腺癌细胞增殖，促进其凋亡[19]。本研究结果显示，不同浓度二甲双胍用于肝癌细胞后，p-AKT和p-mTOR的表达水平均降低。

综上所述，二甲双胍能抑制肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，下调Bcl-2/Bax，其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活有关。