五大连池天然露头泉水源地嗜铁细菌的分离鉴定

刘 威，王菁华，潘 虹，孙义敏，王 松，李月兴，郭新明

（黑龙江省科学院自然与生态研究所，哈尔滨150040）

五大连池隶属黑龙江省黑河市，位于小兴安岭以及松嫩平原交汇地带，具有寒温带大陆性季风气候特征[1]。此矿泉水区域内富含第四系玄武岩潜水，主要为次生矿水，来源并储存在嫩江组下伏的石炭系额头山组片岩、板岩及海西期花岗闪长岩中的原生矿水，沿断裂并垂直向上含水层排泄为主，在局部地段白垩系含水层中形成次生矿水层，在水头压力下向东、东南方向运移，沿南北向张扭性断裂，以泉的形式排出地表，即南饮泉和北饮泉[2]。五大连池重碳酸矿泉水含有多种微量元素[3]，水中铁离子主要以二价铁离子的形态存在，此价态易于人体吸收，是天然的、理想的铁离子优质保健饮品，在医疗保健方面作用明显[4-6]。

微生物在低铁条件下可合成的一类具有小分子量的、能特异地螯合Fe3+特点的螯合因子，为嗜铁素，应用于医药、生物防治方面越来越受到重视[7]。微生物分泌的嗜铁素能活化土壤中的难溶性铁离子，提高铁元素的溶解性和移动性，进而提高土壤中铁元素的生物利用度[8-10]。大量研究表明，嗜铁素在植物病害防治和促进植物生长方面均起着重要的作用[11-15]。嗜铁素除了在生物防治方面的应用越来越多外，还广泛应用于医药等领域[16]。研究人员将药物与嗜铁素通过物理或者化学方法结合起来，形成铁—嗜铁素—连接体—药物的复合物。然后利用微生物特异的铁—嗜铁素转运系统将复合物定向转移到病原菌细胞内，从而像单克隆抗体一样具有靶向作用功能，它可以有效的规避病原菌微生物的耐药性问题[17]。

涌出地面数小时后的天然矿泉水中二氧化碳大量逸失，溶解氧含量增加，导致二价铁离子迅速氧化。故本研究尝试从五大连池天然露头泉水源地筛选分泌嗜铁素的细菌，对菌株形态特征、培养性状、生理生化特性及16S rRNA 序列进行鉴定，为所筛菌株的开发利用提供理论依据与技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品：选取五大连池天然露头泉附近共10 个采样点，采集样品。

1.1.2 培养基。CAS 检测平板[18]。

1.1.3 主要试剂。生理生化试剂盒（海博）；Biospin Bacteria Genomic DNAExtraction Kit 试剂盒购自上海生物工程技术服务有限公司；PCR 扩增的全套试剂购自大连宝生物工程有限公司；16S rRNA 序列扩增引物由上海生物工程技术服务有限公司合成；铬天青成都艾科达化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 嗜铁素分泌细菌的分离与筛选。称取各样本1g，加入 100mL 的 LB 培养液中，在 28℃培养条件下振荡培养48h，转速200r/min。对培养液进行稀释，最后 3 个稀释度（10-5～10-7）各取 100μL，各稀释度做 3个重复。采用CAS 检测平板法，28℃恒温培养5d，观察培养皿菌落生长情况及橘黄色螯合圈的产生。将各单菌落在CAS 固体培养基上进行划线分离并纯化，根据橘黄色菌圈的大小筛选产嗜铁素能力较强的菌株。

1.2.2 菌种鉴定。形态观察：将所筛细菌进行菌落及菌体形态观察，鉴定依据《伯杰氏细菌鉴定手册》进行。生理生化鉴定：参照《伯杰氏细菌鉴定手册第九版》。分子鉴定：16S rRNA 基因的序列分析：将待测的菌种转接于TSB 斜面培养基，待菌种生长成熟后转接于TSB液体培养基中，28℃恒温，250rpm 震荡培养3～7d。离心收集菌体，用无菌水洗涤3 次后置于4℃保存、备用。提取基因组DNA，利用上述提取的基因组DNA 作为 16S rRNA 基因组PCR 扩增的模板，16S 通用引物为27F 和1492R，然后进行胶回收PCR 产物，并采用琼脂糖凝胶电泳进行验证。PCR 回收产物与pMD-18T连接后放入16℃水浴中连接3h 左右，转化DH5a 大肠杆菌感受态细胞；分别提取质粒然后PCR（方法同上），琼脂糖凝胶电泳验证是否为阳性克隆，并送至测序公司测序。将测序结果在NCBI 上，经BLAST 软件与已知的16S rRNA 序列进行相似性分析，选取近源模式种用ClustX 1.81 软件进行多序列比对。在GenBank 数据库中进行相似性搜索，选定其中同源性较高的相关菌株， 用 MAGE 7.0 软件以Neighbor-Joining 方法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与筛选

从10 个采样点中利用CAS 检测平板法初筛获得19 株产嗜铁素细菌。CAS 琼脂培养基中因含有CAS、十六烷基铵（HDTMA）及Fe3+的三元复合物而呈蓝色。当更强的螯合剂将铁从该复合物中移出时，颜色会由蓝色转为橘黄色。挑取初筛平板上产生橘黄色晕圈的菌落（图1 第一排三个平板）和不产生橘黄色晕圈的菌落（图1 第2 排三个平板），如图所示，挑取单菌落接种到CAS 固体平板上培养后，目标菌落在CAS 平板上产生明显的橘黄色晕圈，而没有产嗜铁素细菌的采样点不产生橘黄色晕圈。

2.2 菌株产嗜铁素能力的定性检测

对19 株初筛菌株利用点接培养对产嗜铁素的能力进行定性检测，平板上均出现明显的橘黄色晕圈，说明所筛菌株均具有较强的产嗜铁素能力。选取两株产橘黄色菌圈明显的菌株2-12、3-4，2-12 号较3-4号菌产橘黄色菌圈直径大，如图2 所示，说明2-12 号菌产嗜铁素能力更强。

2.3 嗜铁素分泌细菌的鉴定结果

2.3.1 形态观察结果。筛选出的19 株嗜铁素分泌菌的染色、形态和培养特征：均为革兰氏阴性杆菌，大小在 0.5～0.8μm×1.5～3.0μm 间，1～4 根极生鞭毛，有荚膜，运动，无芽孢。在KMB 平板上，三类菌株菌落圆形隆起，边缘整齐，湿润，粘稠，易挑起，菌落初期透明，后期脓状样，菌落较大且显现不同程度的黄色。

2.3.2 生理生化鉴定结果。依据《伯杰氏细菌鉴定手册》可确认筛选出的19 株嗜铁素分泌菌均为假单胞菌属细菌（Pseudo-monas spp.）。不同菌株生理生化特征如表1 所示，各分离菌株符合假单胞菌的基本特征，在甲基红试验和V-P 试验中均呈阴性，不水解淀粉、乳糖，能还原硝酸盐，均具有氧化酶、双水解酶、精氨酸、过氧化氢酶活性，不产生吲哚和H2S，能在4℃低温生长。这与相关文献报道相符[19，20]。

2.3.3 16S rRNA 基因的序列分析。分离菌株在NCBI上经BLAST 分析，结果表明各菌株均属于假单胞菌属，分别与 Pseudomonas qingdaonensis、Pseudomonas donghuensis 和Pseudomonas protegens 具有最高相似性，序列相似性均大于99%。将测定的假单胞菌16S rRNA序列测定的结果在GenBank 数据库中进行相似性搜索，选定同源性较高的相关菌株，以Neighbor-Joining 方法用MAGE 7.0 软件构建系统发育树，得到相应的分类学上的地位。16S rRNA 基因序列的系统发育分析结果如图3，系统发育树共有3 个分枝，代表有3 个类群，其中类群Ⅰ有12 个菌株，类群Ⅱ有2 个菌株，类群Ⅲ有5 个菌株，各类群之间亲缘关系较远。

图1 产嗜铁素细菌的分离筛选

图2 嗜铁素分泌菌2-12、3-4 嗜铁能力的定性检测

表1 生理生化特性

图3 根据16S rRNA 基因序列构建系统发育进化树

3 结论与讨论

本研究共得到19 株具有分泌嗜铁素功能的细菌，根据菌株形态学特征、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析，各菌株均为假单胞菌属，分别与Pseudomonas qingdaonensis、Pseudomonas donghuensis 和Pseudomonas protegens 具有最高相似性，序列相似性均大于99%。对19 株初筛菌株利用点接培养对其产嗜铁素能力进行定性检测，平板上均出现明显的橘黄色晕圈，具有较强的产嗜铁素能力，选取两株产橘黄色菌圈明显的菌株 2-12、3-4，2-12 号较 3-4 号菌产橘黄色菌圈直径大，2-12 号菌产嗜铁素能力更强。

五大连池南泉矿泉水自然涌出的温度接近于4℃，水中的Fe 主要以Fe2+形式存在，涌出地面数小时后的天然矿泉水中溶解的二氧化碳气体大量逸失，溶解氧含量增加，二价铁离子迅速氧化为三价铁，最终变成氧化铁沉淀。水源地筛选的嗜铁素分泌菌为矿泉水开发中的利用提供了理论依据与技术支持。