PDA-Cu NPs 树莓状纳米粒子的制备及其抗菌性能

朱嘉莹， 李 婷， 丁重阳， 东为富

（江南大学化学与材料工程学院，合成与生物胶体教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

当前，微生物引起的许多问题威胁着人类健康和生存环境。细菌对材料表面的黏附使薄膜[1]、医疗设备[2]、食品和饮料包装[3]等的应用存在极大的被污染隐患。目前常见的制备抗菌材料的主要方法是，在材料表面负载抗菌剂，常用抗菌剂有:天然抗生素[4]、金属和氧化物纳米颗粒[5,6]、季铵化合物[7]和聚吡啶等[8]。

同有机抗菌剂相比，无机抗菌剂特别是金属及其氧化物具有抗菌性强、耐高温、稳定性好等优点。传统的金和银被认为是良好的抗菌材料[9]，然而，高成本限制了它们的应用。因此，廉价的金属无机抗菌剂的研发备受关注。铜作为一种廉价抗菌剂已广泛用于医疗器械[10]、木材防腐[11]、纺织品[12]等领域。目前铜的抗菌机理尚存争议，主流观点认为铜纳米粒子（Cu NPs）吸附在细菌细胞壁表面破坏细胞壁结构，还原性的Cu NPs与细菌相互作用后在细胞壁的表面释放活性氧（ROS），逐渐破坏细胞结构，且铜释放出的铜离子也可有效抑制周围细菌生长[13]。尽管Cu NPs 显示出优异的抗菌性能，但是过量的铜离子亦将对人类健康构成威胁[14]。当游离的铜离子进入人体后，会危害器官，特别是肝脏和胆囊；另外，它对许多水生生物也都有很大的负面影响。因此，为了减轻铜离子的危害，选择合适的载体非常重要。此外，Cu NPs 易于聚集的问题使其实际应用面临着巨大挑战。目前防止Cu NPs 聚集的有效方法是将其沉积在固体多孔材料上，例如SiO2、沸石和碳材料等[15,16]。其中许多多孔材料表面可用多巴胺预先修饰以达到对金属离子吸附的目的[17,18]。

聚多巴胺（PDA）纳米粒子由多巴胺自聚而成，由于PDA 中存在许多功能基团，包括邻醌、邻苯二酚、氨基、亚氨基等[19]，它可与多种多价金属离子结合，如Fe3+、Ag+、Cu2+等。金属离子Cu2+经过氧化还原后可与PDA 形成金属粒子负载的PDA 复合微球，其优点主要为:（1）PDA 微球易于合成且产率高；（2）PDA 丰富的儿茶酚和氨基可以通过紧密结合的方式络合Cu NPs；（3）PDA 球表面上Cu NPs 的覆盖率可控。

本文利用多巴胺结合金属离子的能力将铜离子固定在PDA 表面，用水合肼原位还原铜离子，形成树莓结构的PDA-Cu NPs，并进一步研究了该复合微球的抗菌性能。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

盐酸多巴胺:化学纯，上海阿拉丁试剂有限公司；三水合硝酸铜（Cu（NO3）2·3H2O，化学纯）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，优级纯）、水合肼（H6N2O，w=85%，化学纯）:国药集团化学试剂有限公司；实验室用水为去离子水。

1.2 测试与表征

1.2.1 纳米粒子的基本结构表征 场发射扫描电子显微镜（SEM）:日本日立株式会社S-4800 型，将制备的纳米粒子置于真空烘箱充分干燥，并固定于电镜台喷金处理进行测试；X 射线衍射（XRD）仪:德国布鲁克AXS有限公司 Bruker D8 型，扫描范围10°～90°，扫描速率3（°）/min；Zeta 电位及纳米粒度分析仪:美国布鲁克海文公司 ZetaPALS 型，测试温度为25 ℃；接触角测量仪:北京东方德菲仪器有限公司 OCA40 型，将样品分散在无水乙醇中并将分散液平铺于载玻片上，干燥后测量。

1.2.2 细菌培养 制备细菌悬浮液的过程如下:取50 μL 大肠杆菌（E.coil，ATCC#25922）或表皮葡萄球菌（S.epidermidis，ATCC#12228）的菌原液注入15 mL 的无菌Luria-Bertani（LB）肉汤中，放入37 ℃的摇床中振荡培养5 h 后，用无菌超纯水稀释至105CFU/mL 备用。

1.2.3 PDA-Cu NPs 的抗菌性能测试 采用摇瓶法测试纳米粒子的抗菌性能[20]。将1 mL 纳米粒子的水分散液（5 mg/mL）加入至含有9 mL 菌悬液（105CFU/mL）的烧瓶中。将烧瓶保持在37 ℃的振动台上20 min 后，取出100 μL 混合悬浮液并稀释至合适浓度。将每种稀释液（100 μL）接种到LB 固体培养基上，然后翻转平板在37 ℃恒温箱中孵育24 h 后统计细菌菌落数。

采用纸片扩散法测试纳米粒子的抗菌性能。将无菌滤纸裁成直径为6 mm 的圆形，将100 μL 的原菌液涂布在琼脂板上，随后放入剪裁好的纸片，将相同浓度不同铜含量的PDA-Cu NPs 分散液滴在纸片上，在37 ℃下孵育24 h 后观察抑菌圈尺寸。

采用肉汤基稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MBC）。将PDA-Cu NPs 稀释至250 mg/mL 灭菌备用。取若干试管标记为1～7。1 号试管中加入5 mL 培养基和4 mL 去离子水，其余试管均加入2.5 mL 培养基和2.5 mL 去离子水，灭菌。取1 mL PDA-Cu NPs 稀释液至1 号试管中，振荡分散。然后从1 号试管中取5 mL溶液至2 号试管中，重复上述步骤直至7 号试管，最后从7 号试管中取5 mL 弃去。每支试管中接入0.5 mL、105CFU/mL 菌液。对照组为2.5 mL 培养基和2.5 mL 去离子水，一支加入0.5 mL 去离子水（空白对照），另一支加入0.5 mL 菌液（阳性对照），37 ℃下培养12 h，试管中溶液开始澄清的浓度即为MIC。

从出现澄清溶液的试管中取出100 μL 稀释液接种到LB 固体培养基上，然后翻转平板在37 ℃恒温箱中孵育24 h 后统计细菌菌落数。当培养皿中的菌落数少于5 个时，最低的质量浓度即为MBC。

1.3 实验步骤

1.3.1 PDA 的制备 根据文献[21]制备PDA。将0.18 g 盐酸多巴胺溶于90 mL 去离子水中，于50 ℃下充分搅拌，再加入0.38 mL、1 mol/L 的氢氧化钠溶液，反应5 h 后离心数次，置于60 ℃烘箱中干燥即得到产物PDA。

1.3.2 PDA-Cu NPs 的制备 取已烘干的PDA 颗粒50 mg，配成1 mg/mL 的水溶液，用细胞粉碎机使颗粒均匀分散在溶液中，随后加入150 mg 的PVP，300 mg 的Cu（NO3）2·3H2O，在室温下搅拌4 h 后转移到60 ℃的油浴锅中，加入2.1 g 的水合肼，反应1 h 后，离心数次得到PDA-Cu NPs，置于60 ℃烘箱中干燥备用。文中按m（PDA）/m（Cu（NO3）2）=x/y，将产物标记为PDA-Cu NPs（x/y），其制备示意图见图1。

图1 PDA-Cu NPs 的合成示意图Fig.1 Synthesis of PDA-Cu NPs

2 结果与讨论

2.1 纳米粒子的微观形貌及粒径

PDA 和PDA-Cu NPs 的微观形貌如图2 所示。图2（a）中，纯PDA 表面较为光滑，粒径为500 nm 左右。据文献[19]报道，PDA 可以鳌合金属离子并将其原位还原，但从图2（b）可以看出，在不添加还原剂水合肼的情况下，PDA 与Cu（NO3）2溶液搅拌24 h 后，只有少量的Cu NPs 被还原，说明其自身还原性不足以在表面大量还原Cu NPs。从图2（c）中可以看出，选用水合肼作为还原剂制备的PDA-Cu NPs（1/4），大量Cu NPs 被还原，其平均直径约为50 nm，并负载于PDA 表面。

图2 （a） PDA，（b） 仅由PDA 还原的PDA-Cu NPs（1/4）和（c）由水合肼还原的PDA-Cu NPs（1/4） 的纳米粒子SEM 照片Fig.2 SEM images of （a） PDA, （b） PDA-Cu NPs（1/4） reduced by PDA only and （c） PDA-Cu NPs（1/4） reduced by H6N2O

Cu（NO3）2含量对Cu NPs 在PDA 上分散均匀性的影响如图3 所示，从图3（a，b）中可以看出，当m（PDA）∶m（Cu（NO3）2）=1∶2，1∶4 时，负载在PDA 表面的Cu NPs 较少，随着Cu（NO3）2用量的增加，PDA 表面的Cu NPs 增加，且分布较为分散（图3（c））；继续增加Cu（NO3）2的用量，如图3（d）所示，部分Cu NPs 在PDA 表面出现团聚现象，会影响其Cu2+的释放。

图3 PDA-Cu NPs 的SEM 照片Fig.3 SEM images of PDA-Cu NPs

还原温度对PDA 表面Cu NPs 粒径的影响如图4 所示。当还原温度较低时（20，40 ℃），PDA 表面Cu NPs的粒径不均一（图4（a，b））；当还原温度进一步升高时（60 ℃），PDA 表面的Cu NPs 粒径较均一，约为50 nm（图4（c，d））。进一步升高还原温度（80 ℃），Cu NPs 粒径没有明显变化，故选择60 ℃作为制备PDA-Cu NPs的最佳还原温度。

图5 显示了引入Cu NPs 前后PDA 平均粒径的变化。PDA 的平均粒径约为600 nm，PDA-Cu NPs 的平均粒径为650 nm 左右，显示了负载Cu NPs 后PDA 微球平均粒径的增大。两者粒径分布都较宽，同SEM 结果对照，纳米粒度仪所测数值偏大，这是由于部分粒径的PDA 发生了团聚，这也是粒径分布较宽的原因，但从图5（b，b’）和图5（c，c’）来看， PDA 以及PDA-Cu NPs 分散液在静置24 h 后未出现明显的分层情况，显示出纳米颗粒良好的分散稳定性。

2.2 纳米粒子的Zeta 电位和XRD 分析

图4 不同还原温度下PDA-Cu NPs（1/4）的SEM 照片Fig.4 SEM images of PDA-Cu NPs（1/4） reduced at different temperatures

图5 （a） PDA 与PDA-Cu NPs 的粒径分布；（b） PDA 分散后和 （b’）静置24 h 后的照片；（c） PDA-Cu NPs 分散后和（c’）静置24 h 后的照片Fig.5 （a） Particle size distribution of PDA and PDA-Cu NPs; Photos of （b） PDA suspension and （b’） PDA suspension after standing 24 h;Photos of （c） PDA-Cu NPs suspension and （c’） PDA-Cu NPs suspension after standing 24 h

表1 为PDA 与PDA-Cu NPs 在水中的Zeta 电位数据。纯PDA 纳米粒子的负电位（-29.4 mV）是由PDA纳米粒子表面带负电的羟基引起的。当带负电位的羟基与金属离子络合还原后，带正电的Cu NPs 与带负电的羟基反应，使PDA-Cu NPs 纳米粒子的表面电位增加，其电位向正方向移动。从表1 中可以看出，随着Cu（NO3）2含量的增加，PDA-Cu NPs 粒子的表面电位逐渐提高，表明PDA 上Cu NPs 的含量亦随之增加，与其SEM 分析结果相互印证。

图6 为纯PDA 与PDA-Cu NPs 的XRD 衍射图谱。从图6 中可以看出，PDA 的XRD 图谱表现出典型的非晶衍射特征，说明其为无定形结构。PDACu NPs 在43°、50°和74°的特征峰分别归属于纯铜的（111）、（200）和（220）晶面（JCPDS 卡号04-0836），而纯PDA 不具有此类晶面，也说明Cu NPs 确实负载于PDA 表面。

2.3 接触角测试

图7 展示了PDA 以及PDA-Cu NPs 构成表面的润湿状态。从图中可以看出，纯PDA 构成的表面亲水，接触角为28.9°，这是由于其表面含有大量亲水性基团。虽然纯PDA 与Cu NPs 自身都表现出亲水性，但当Cu NPs 负载于PDA 球后，形成的树莓状纳米粒子粗糙度提升，PDA-Cu NPs（1/6）的接触角可达92.9°，表现为疏水性，PDA-Cu NPs（1/8）的表面接触角可提高至102.2°。

表1 PDA 和PDA-Cu NPs 的Zeta 电位Table 1 Zeta potential of PDA and PDA-Cu NPs

图7 PDA 和PDA-Cu NPs 的水接触角Fig.7 Water contact angles of PDA and PDA-Cu NPs

2.4 纳米粒子的抗菌测试

图8 显示了PDA-Cu NPs 对大肠杆菌和表皮葡萄球菌的抗菌性能。从图8（a）中可以看出，PDA-Cu NPs（1/2）的抗菌率只达到约45%，抗菌性能较差；PDA-Cu NPs（1/4）的抗菌率可达到85%以上，PDA-Cu NPs（1/8）可实现对细菌的100%杀死，显示出优异的抗菌性能。

图8 （a） 铜含量对PDA-Cu NPs 抗菌性能的影响;（b） PDA-Cu NPs 对大肠杆菌的抑菌圈照片Fig.8 （a） Effect of copper source content on antibacterial properties of PDA-Cu NPs; （b） Inhibition zone picture of PDA-Cu NPs to E.coli

从图8（a）还可以看出，所制备的纳米粒子对表皮葡萄球菌的抗菌性能要明显优于对大肠杆菌的，这可能是因为与革兰氏阳性细菌（表皮葡萄球菌）相比，革兰氏阴性细菌（大肠杆菌）除了肽聚糖外还具有外膜结构，该外膜可以保护细菌免受攻击。

图8（b）显示出不同粒子对大肠杆菌的抑菌圈大小，从图中可以看出，PDA-Cu NPs（1/2）和PDA-Cu NPs（1/4）抑菌圈不明显，PDA-Cu NPs（1/6）则出现明显的抑菌圈，显示出较高的抗菌性能，且其抑菌圈直径大于PDACu NPs（1/8）的，结合SEM 分析，可能因为铜含量较高时，引起Cu NPs 的团聚，从而影响其抗菌性能。

PDA-Cu NPs（1/6）对表皮葡萄球菌和大肠杆菌的MIC 和MBC 测试结果列于表2。从表2 可以看出，PDA-Cu NPs（1/6）对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有很高的抗菌活性。PDA-Cu NPs（1/6）对大肠杆菌的MIC 和MBC 值分别为48.7 μg/mL和195.0 μg/mL，对表皮葡萄球菌的MIC 和MBC 值分别为39.0 μg/mL 和97.5 μg/mL。

3 结 论

（1）通过简单调节反应物投料比以及还原温度可以实现Cu NPs 在PDA 上的均匀分散，成功制备一种简单高效且价格低廉的抗菌剂。

（2）得益于Cu NPs 对表皮葡萄球菌和大肠杆菌优异的抗菌性能以及PDA 的生物相容性，此树莓状PDA-Cu NPs 纳米粒子在生物医疗等方面应用前景可期。

表2 PDA-Cu NPs（1/6）对不同细菌的抗菌效果Table 2 Antibacterial efficency of the synthesized PDA-Cu NPs（1/6）against different bacteria