宫颈癌组织中Hippo-Yes相关蛋白1的表达及临床意义

王文慧，邵志叶，陈豪

（1.杭州市妇产科医院 病理科，浙江 杭州 310000；2.慈溪市妇幼保健院病理科，浙江 慈溪 315300）

人乳头瘤病毒感染为宫颈癌发病的根本原因，而宫颈癌发病是一个复杂的过程，其发病机制尚不十分清楚。随着研究的不断深入，人们逐渐认识到宫颈癌的发病是一个多因素、多步骤共同导致的过程，从正常宫颈发展到宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN），再发展为宫颈癌。在这个过程中，原癌基因激活和抑癌基因突变或缺失发挥重要作用。关于原癌基因和抑癌基因变化的研究是宫颈癌发病机制研究的热点。Hippo信号通路为恶性肿瘤的抑制通路，在恶性肿瘤发病中发挥重要作用[1]，Hippo-Yes相关蛋白1（Hippo-Yes-associated protein1,YAP1）位于该通路下游，为Hippo 通路转录共激活因子[2]，参与生长、发育及DNA 修复等过程，在结直肠癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中表达升高，发挥抑癌基因的角色[3]。本文对宫颈癌组织中YAP1表达进行研究，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月—2019年6月杭州市妇产科医院和慈溪市妇幼保健院收治的100例宫颈癌患者的宫颈癌组织作为宫颈癌组，100例宫颈CIN 患者的宫颈组织作为CIN组，100例子宫肌瘤患者的正常宫颈组织作为正常组。宫颈癌组年龄（48.75±6.16）岁；临床分期：I期58例，Ⅱ期42例；鳞癌69例、腺癌31例；低分化19例，中分化42例，高分化39例；宫旁浸润深度：≤1/3 者31例，＞1/3 者69例；神经脉管浸润67例；宫旁浸润65例；淋巴结转移53例。CIN组年龄（47.59±6.54）岁，正常组年龄（47.82±6.73）岁。纳入标准：①正常组选自子宫肌瘤行全子宫切除术患者，病理证实宫颈组织正常；②CIN组选自宫颈锥切患者，病理证实为宫颈CIN；③宫颈癌组为行广泛性子宫切除术+盆腔淋巴结切除术患者，病理证实为宫颈癌；④3组均临床资料完整、依从性好、接受正规治疗和随访，以及足够样本量进行免疫组织化学染色。排除标准：①其他恶性肿瘤；②随访过程中失访；③宫颈癌复发；④既往接受放化疗等其他治疗。本研究通过医院伦理委员会批准，患者及其家属知情同意。3组年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及仪器鼠抗人YAP1 单克隆抗体购自美国Epitomics公司，二抗购自上海罗氏有限公司，DAB显色剂购自上海罗氏有限公司。

1.2.2 免疫组织化学染色将3组宫颈组织石蜡切片经烤箱烘烤1 h，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，柠檬酸缓冲液高温修复抗原，过氧化氢孵育10 min，加入一抗。兔抗人YAP1 单克隆抗体（1∶400）过夜孵育，加入二抗（1∶2 000）孵育1 h，DAB显色，HE染色1 min，盐酸乙醇分化30 s，氨水返蓝1 min，常规脱水、透明、封固。阴性对照以PBS代替一抗。结果判断：YAP1阳性产物主要位于细胞浆和细胞核。①染色程度：无染色计0分；淡黄色计1分；棕黄色计2分；棕褐色计3分。②阳性细胞率：≤5%计0分；＞5%～25%计1分；＞25%～50%计2分；＞50%～75%计3分；＞75%计6分。染色程度和阳性细胞染色率相乘得到总分：总分0～2分为阴性；总分≥3分为阳性[4]。

1.3 随访

定期进行门诊或电话随访了解患者预后，随访开始时间为宫颈癌手术日期，随访截止时间为2019年12月31 日或死亡时间。无病生存期（disease-free survival,DFS）为手术日期至出现远处转移、复发、死亡或随访截止时间；总生存期（total survival,OS）为手术日期至死亡或随访截止时间。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件。计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；Kaplan-Meie 法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验；预后影响因素用多因素Cox 比例风险模型，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组宫颈组织中YAP1蛋白阳性表达率比较

正常组、CIN组、宫颈癌组宫颈组织中YAP1蛋白阳性表达率分别为13%、42%和78%，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=85.930，P=0.000），CIN组、宫颈癌组高于正常组（P＜0.05），且宫颈癌组高于CIN组（P＜0.05）。见图1。

图1 各组宫颈组织染色 （×400）

2.2 不同因素的宫颈癌组织中YAP1蛋白阳性表达率比较

不同临床分期和有无淋巴结转移患者宫颈癌组织中YAP1蛋白阳性表达率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05），临床分期Ⅱ期宫颈癌组织中YAP1蛋白阳性表达率高于I期；有淋巴结转移宫颈癌组织中YAP1蛋白阳性表达率高于无淋巴结转移。而不同年龄、组织学类型、组织学分级、宫颈浸润深度、神经脉管是否浸润及宫旁是否浸润的宫颈癌组织中YAP1蛋白阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 宫颈癌YAP1阳性表达组和阴性表达组生存时间比较

100例宫颈癌患者DFS中位数为61.15个月（95% CI：58.76，63.32）。其中，宫颈癌YAP1阳性表达组78例，DFS中位数为54.27个月（95% CI：52.16，67.36），5年DFS率为3.85%（3/78）；YAP1 阴性表达组22例，DFS中位数为87.76个月（95% CI：85.54，90.73），5年DFS率为0.00%（0/22）。两组DFS比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=5.241，P=0.023），YAP1阳性表达组低于YAP1阴性表达组。见图2。

100例宫颈癌患者OS中位数为63.57个月（95% CI：61.25，65.02）。其中，宫颈癌YAP1阳性表达组OS中位数为61.27个月（95% CI：58.76，53.64）；YAP1 阴性表达组OS中位数为93.61个月（95% CI：90.25，96.02）。两组OS比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=6.201，P=0.014），YAP1阳性表达组低于YAP1 阴性表达组。见图3。

2.4 YAP1 对宫颈癌预后的影响

以OS为因变量（赋值为总生存期实际值），以YAP1（阳性=1，阴性=0）、肿瘤大小（赋值为实测值）、临床分期（I期=0，Ⅱ期=1）、淋巴结转移（无=0，有=1）为自变量，进行逐步多因素Cox 比例风险分析，引入水准为0.05，剔除水准为0.10。Cox 比例风险模型分析结果显示，YAP1表达、临床分期及淋巴结转移为宫颈癌OS的独立影响因素（P＜0.05）。见表2。

表1 不同因素的宫颈癌组织中YAP1蛋白阳性表达率比较 （n=100）

图2 YAP1不同表达宫颈癌患者的DFS

图3 YAP1不同表达宫颈癌患者的OS

表2 宫颈癌总生存期影响因素的Cox比例风险分析参数

3 讨论

Hippo信号通路参与多种疾病的发生、发展过程，与恶性肿瘤的发病关系密切，尤其与其抑癌基因失活关系密切[5-6]。YAP1被证实为原癌基因，保护多个特异氨基酸结构域，通过这些氨基酸结构域与一些蛋白质发生作用，参与多种信号转导通路[7]。在Hippo 信号通路中，YAP1 发挥中心效应作用[8]。在生理条件下Hippo信号通路为一条激酶链，由多种抑癌因子共同构成，通过使YAP1 磷酸化，进而抑制YAP1 转录共激活活性，维持细胞增殖和凋亡的平衡[9-10]。当YAP1 过度表达或活性增加时，可激活下游靶基因表达，从而改变细胞增殖和凋亡的平衡[11-12]。在恶性肿瘤组织中，Hippo信号通路遭到破坏，导致YAP1 去磷酸化，活性增加，活化的YAP1 可诱导细胞增生相关的基因高度表达、抑制凋亡基因过度表达，从而打破细胞增殖和凋亡的平衡，促进细胞过度增殖[13]，导致乳腺癌[14]、胰腺癌[15]等恶性肿瘤的发生、发展。故推测YAP1 在恶性肿瘤的发生、发展中发挥致癌基因角色[16-17]。

HE 等[18]发现，Hippo/YAP途径和HPV致瘤蛋白相互作用调节宫颈癌的进展。ZHANG 等[19]发现，miR-136/TFCP2/YAP 途径在宫颈癌中发挥致癌作用。惠慧等[20]发现，沉默YAP1 可影响宫颈癌细胞的增殖和侵袭。上述研究表明，YAP1 可通过多种途径参与宫颈癌的发生、发展过程，但上述研究主要对宫颈癌细胞进行研究。本文对宫颈癌组织中YAP1的表达及临床意义进行研究，发现宫颈癌组织中YAP1高表达率高于宫颈CIN组织，宫颈CIN组织中YAP1高表达率高于正常宫颈组织，宫颈癌组织中YAP1高表达与宫颈癌的临床分期和淋巴结转移关系密切。李灵芝等[21]对宫颈癌组织中YAP1表达进行研究发现，YAP1蛋白在宫颈癌前病变中呈高表达，在宫颈癌筛查中具有一定价值。本研究结果与该研究结果一致，表明YAP1 在宫颈癌癌前病变中已表达异常，检测YAP1表达在宫颈癌筛查和防治中具有一定价值。李娜等[4]研究发现，YAP 在宫颈癌组织中高表达，其高表达与宫颈癌淋巴结转移关系密切，与宫颈癌临床分期无关。而本研究结果显示，宫颈癌组织中YAP1与宫颈癌临床分期和淋巴结转移均有关。本研究与李娜等[4]研究结果不完全一致，分析可能与病例数少、病例来自不同医院等因素有关。结合上述基础研究结果得知，沉默YAP1 可影响宫颈癌细胞增殖和侵袭，分析YAP1在宫颈癌增殖和侵袭中发挥重要作用，YAP1高表达可促进宫颈癌增殖和侵袭。

本文对YAP1高表达与宫颈癌预后的关系进行研究，发现YAP1高表达组患者DFS和OS较短，YAP1表达为宫颈癌OS的独立影响因素。分析在宫颈癌组织中，Hippo信号通路受到破坏，导致YAP1 去磷酸化，YAP1 活性增加，活化的YAP1 可诱导宫颈癌细胞增殖，促进其侵袭能力，从而促进宫颈癌的发生、发展，宫颈癌临床分期较高，并出现淋巴结转移，导致宫颈癌严重程度增加，预后较差。

综上所述，宫颈癌组织中YAP1 呈高表达，YAP1表达水平一定程度上可反映宫颈癌的严重程度，在预测预后上也具有一定的辅助价值。