松萝酸对3种肿瘤细胞增殖和凋亡的影响

于大永，郭秀磊，高鸿雁，曹 鹤，史丽颖

（大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连116622）

松萝酸是地衣类植物中常见的一种代谢产物，为二苯丙呋喃类化合物.1844年，德国科学家W.Knop首次在地衣中发现松萝酸并分离出来，1933年开始被人工大量合成[1].松萝酸有2种对应异构体，分别为（-）-松萝酸和（+）-松萝酸[2].松萝酸主要存在于松萝等地衣植物中，这种地衣植物在我国主要分布于新疆、甘肃、陕西等地.松萝酸具有抗炎、抗菌、抗病毒等作用[3-4]，常被用作牙膏和化妆品的添加剂.在美国，其钠盐一般用作补充剂来控制体重[5].以往对于松萝酸的研究主要集中在抗菌、抗炎、抗病毒等方面，近年来关于松萝酸抗肿瘤方面的研究逐渐增多.如郝凯华等[6]研究发现，松萝酸能够抑制小鼠H22细胞的增殖以及血管生成，明显抑制了VGEF和bFGF的表达；Geng等[7]对肺癌细胞BGC823和SGC7901的研究表明，松萝酸能够引起细胞发生G1期和G2期阻滞，从而使细胞发生凋亡；左舒婷[8]研究发现，松萝酸能够体外特异性地杀死乳腺癌细胞.

白血病是发生于血液和骨髓中的恶性肿瘤，由于白血病细胞具有可以避免生长停滞和终末分化的特性，因此白血病治愈的难度非常大[9-11].骨肉瘤是较常见的发生于青少年或儿童的一种恶性骨肿瘤，根据最新的癌症统计数据，骨肉瘤在美国最常见的儿童和青少年癌症中存活率最低[12-13].恶性黑色素瘤是一种侵袭性和治疗抵抗性黑色素细胞恶性肿瘤[14]，在世界范围内发病数量约占所有恶性肿瘤的3%.为了进一步挖掘松萝酸在肿瘤治疗方面的应用潜力，本研究分别以人白血病细胞U937、人骨肉瘤细胞MG-63和人黑色素瘤细胞A375这3种肿瘤细胞为材料，通过MTT实验检测松萝酸对这3种细胞增殖的抑制情况，并筛选出抑制效果最好的细胞.同时，利用Hoechst 33342染色和Western Blot方法，初步研究松萝酸对肿瘤细胞增殖的抑制作用机制，为松萝酸抗肿瘤的新药开发及其临床应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 细胞株

人白血病细胞U937，Human Sciences Research Bank（日本人类科学基金会，日本东京）；人骨肉瘤细胞MG-63，大连大学医学院；人黑色素瘤细胞A375，大连大学生命科学与技术学院.

1.1.2 主要试剂

松萝酸，阿拉丁试剂公司；MTT、DMSO、Caspase-3、GAPDH和抗体，生工生物工程上海股份有限公司；Hoechst 33342染料，北京索莱宝试剂公司；5-氟尿嘧啶（5-Fu），天津金耀氨基酸有限公司；蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，瑞士Roche公司；BCA Protein Assay Kit，碧云天生物技术研究所；超敏ECL化学发光试剂盒，北京全式金生物技术有限公司；Bax抗体、Bcl-2抗体和HRP标记山羊抗兔IgG，武汉博士德生物有限公司.

1.1.3 主要仪器

二氧化碳培养箱，新加坡ESCO公司；酶标仪、ini-PROTEN system Casting stand制 胶 器、Mini-PROTEN Tetra System电泳槽和PowerPacTM Basic电泳仪，美国BIO-RAD公司；SYGN2/7503化学发光凝胶成像系统，英国基因公司.

1.2 方法

1.2.1 药品的制备

松萝酸（相对分子质量为344.32）溶于一定量的DMSO中，使母液的浓度为50 mmol/L（DMSO的终体积分数小于0.5%），除菌后-20℃保存.

1.2.2 细胞株的培养

用含有灭活的胎牛血清（体积分数为10%）的RPMI-1640培养基培养U937细胞；用含有10%灭活的胎牛血清的DMEM培养基培养MG-63和A375细胞.3种细胞均在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下进行培养，每2 d换液1次，每3 d传代1次，使细胞一直保持在对数生长期，以便用于后续实验.

1.2.3 MTT法对药物增殖抑制作用的测定

选取处于对数生长期的上述3种细胞，台盘蓝染色，利用血球计数板计数，选取存活率不低于95%的细胞进行实验.调整U937细胞的浓度为4×104mL-1，MG-63和A375细胞的浓度均为2×104mL-1，接种于96孔板中.MG-63和A375细胞培养12 h后用松萝酸处理，U937直接用松萝酸处理.用无血清的培养基稀释松萝酸母液，使其浓度分别为12.5、25.0、50.0、100.0μmol/L，依次加入96孔板中，阳性对照组中加入5-氟尿嘧啶（终浓度为100μmol/L）.于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下分别培养24 h和48 h.松萝酸处理终止前4 h加入10μL的MTT溶液（5 g/L），相同条件下培养4 h后向含有U937细胞的96孔板中加入200μL的盐酸-SDS-异丁醇三联液，继续在相同条件下培养过夜，利用酶标仪在570 nm处测定吸光度值OD570.将含有A375和MG-63细胞的96孔板倒掉上清液，吸去多余液体，每孔加入200μL的DMSO，在摇床上摇晃20 min后于490 nm处测定吸光度值OD490.计算抑制率，实验重复3次.

1.2.4 细胞凋亡形态学观察

调整细胞浓度为3×105mL-1，向6孔板中加入处于对数生长期的U937细胞，利用不同浓度梯度的松萝酸（0、50、75、100μmol/L）处理6 h后，对照组中加入5-氟尿嘧啶.加入适量的Hoechst 33342溶液（1 mg/mL），使得工作质量浓度为2μg/mL，避光染色10 min，收集细胞，利用PBS清洗3遍，用荧光显微镜（日本Nikon公司）拍照.

1.2.5 Western Blot检测蛋白变化

选取处于对数生长期的人白血病细胞U937，调整细胞浓度为2×106mL-1，接入6孔板中，加入待测的药物松萝酸使其终浓度分别为50、75、100μmol/L.加药处理6 h后，加入150μL的蛋白裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，用Western Blot法测定促凋亡蛋白Bax、逆凋亡蛋白Bcl-2、Caspase-3以及GAPDH的表达，利用Image J软件分析灰度值.

1.3 数据统计

实验重复3次.利用SPSS 25.0进行单因素方差分析，采用LSD检验进行多重比较.以0.01＜P＜0.05为差异具有统计学意义，P＜0.01为差异具有高度统计学意义.

2 结果与分析

2.1 松萝酸对3种肿瘤细胞增殖的抑制作用

不同浓度的松萝酸对3种肿瘤细胞增殖的抑制情况如表1所示.

表1 松萝酸对3种肿瘤细胞的抑制率Tab.1 Inhibitory rates of three kinds of tumor cells treated with usnic acid %

由表1可以看出，随着处理浓度的增加，松萝酸对3种细胞增殖的抑制作用均增强，且与对照组的差异多数具有统计学意义（P＜0.05）.这表明松萝酸对3种肿瘤细胞均有增殖抑制作用并且呈现出剂量依赖性.不同浓度处理组中，松萝酸对3种细胞的抑制率总体上随着处理时间的延长而增加.

计算松萝酸对3种肿瘤细胞的IC50值，结果如图1所示.

图1 松萝酸对3种肿瘤细胞的IC50值Fig.1 IC50 value of three kinds of tumor cells treated with usnic acid

由图1可以看出，3种细胞在处理48 h时的IC50均低于24 h时的数值，即松萝酸对3种肿瘤细胞的抑制作用具有时间依赖性.作用24 h时，U937、A375和MG-63的IC50分别为90.90、139.48和103.00μmol/L；作用48 h时，3种细胞的IC50分别为54.08、65.39和90.48μmol/L.比较3种肿瘤细胞的IC50可知，松萝酸对人白血病细胞U937的抑制效果最好.

2.2 细胞凋亡形态学观察

不同浓度的松萝酸处理人白血病细胞U937 6 h后，细胞生长情况如图2所示.

图2 松萝酸对人白血病细胞U937凋亡形态学的影响（×200）Fig.2 Effect of usnic acid on the apoptotic morphology of U937（×200）

由图2可以看出，同对照组相比，50μmol/L处理组中细胞就已经出现了明显的凋亡特征，细胞核的体积缩小，细胞核裂解并伴有凋亡小体.随着松萝酸浓度的增加，细胞裂解地更加充分，凋亡细胞数量显著增加.

2.3 Western Blot检测凋亡蛋白的表达情况

利用Western Blot检测松萝酸处理下肿瘤细胞凋亡相关蛋白的变化，结果如图3所示.

图3 松萝酸处理U937 6 h后凋亡相关蛋白的变化Fig.3 Expression of proteins related with apoptosis in U937 cells treated with usnic acid for 6 h

由图3可以看出，随着松萝酸处理浓度的增加，促凋亡蛋白Bax的表达量上调，50、75和100μmol/L处理组中的Bax表达量均显著高于对照组（P＜0.05）.逆凋亡蛋白Bcl-2和Caspase-3的表达量均随着松萝酸处理浓度的增加而显著下降，3个处理组的表达量均显著低于对照组.由于Bax的表达量上升Bcl-2的表达量下降，导致Bax/Bcl-2比值增大.

3 讨论

本研究用不同浓度的松萝酸处理人白血病细胞U937、人骨肉瘤细胞MG-63和人黑色素瘤细胞A375，探究松萝酸对这3种肿瘤细胞增殖的抑制效果.结果发现，松萝酸对3种肿瘤细胞均有增殖抑制作用，并呈现出剂量和时间依赖关系.比较松萝酸对3种肿瘤细胞的抑制效果，发现松萝酸对人白血病细胞U937的抑制效果最好，其次是人黑色素瘤细胞A375.通过Hoechst 33342染色发现松萝酸能够诱导人白血病细胞U937发生凋亡，从而抑制其生长.

左舒婷[8]的研究表明，松萝酸体外特异性地杀死乳腺癌细胞主要是通过ROS介导的线粒体凋亡实现的.Fan等[15]研究发现，松萝酸对2个髓性白血病细胞系中Mnk1/el F4E和Pim-1/4E-BP1的信号传导作用均有抑制作用，可能是一种潜在的原癌基因Pim-1抑制剂.Galanty等[16]研究松萝酸对前列腺癌细胞和黑色素瘤细胞HTC-140的作用，发现松萝酸除了具有抑制细胞增殖的作用外还可抑制肿瘤细胞的迁移，这使得松萝酸有望被用于针对肿瘤细胞转移级联反应过程的治疗.

利用Western Blot检测松萝酸处理人白血病细胞U937后肿瘤相关蛋白包括Bax、Bcl-2、Caspase-3的变化.Bcl-2家族是细胞凋亡的重要调节因子，可通过调控线粒体膜的透性控制线粒体凋亡，该家族成员包括促凋亡蛋白（如Bax）和逆凋亡蛋白（如Bcl-2）[17-18]，二者比值决定细胞的命运，如果比值变大，即增加Bax表达或降低Bcl-2的表达，就会促进细胞凋亡.半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族在细胞凋亡过程中也发挥着重要作用，Caspase-3是细胞凋亡的主要效应者[19-21].本研究发现，松萝酸处理U937后，细胞中Bax蛋白的表达量上升，Bcl-2蛋白的表达量降低，Caspase-3蛋白表达量下调，Bax/Bcl-2比值增大，即松萝酸也是通过Caspase依赖性线粒体途径诱导人白血病细胞的凋亡.